[发明专利]一种构建自组装表达双酶菌株的方法及应用

说明书

本发明涉及一种构建自组装表达双酶菌株的方法及应用，本发明通过构建不同比例和不同结构的MTSase‑MTHase多酶复合体，获得大肠杆菌重组子；本发明发现不同比例的MTSase‑MTHase多酶复合体，获得的大肠杆菌重组子对海藻糖的转化率有一定影响；相同比例、结构不同的MTSase‑MTHase多酶复合体，获得的大肠杆菌重组子对海藻糖的转化率影响较大；为多酶体系发酵生产海藻糖的研究提供了理论依据。

技术领域

本研究涉及一种构建自组装表达双酶菌株的方法及应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

海藻糖(α,α-海藻糖，Trehalose)最早是1832年Wiggers在黑麦的麦角菌中发现的，自然界中的海藻糖是由两分子葡萄糖通过α-1,1-糖苷键连接而成，不易被酸水解，并且α-1,1-糖苷键不能被α-葡萄糖苷酶酶切。海藻糖因其对生物大分子生命体具有优良的抗逆保护特性，被称为“生命之糖”，在食品运输、医药保藏等方面具有较广的应用。

目前双酶法生产海藻糖成为国内外企业工业化生产的首选，这种生产方法产物得率较高，生产成本较低，适合工业化生产，由于双酶法是由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)连续作用才会产生海藻糖，两个酶由两个菌株单独表达，会造成人力和物力的浪费。来源于CnaB2结构域的SpyTag-SpyCatcher体系，在蛋白质自组装领域占有重要的地位，并且有着广泛的应用，同时利用SpyTag-SpyCatcher在重组蛋白任何位置都不会影响重组蛋白活性的特性。但是现有技术中，并未报道利用自组装体系在重组大肠杆菌中构建不同比例、不同结构的MTSase-MTHase多酶复合体，对海藻糖转化率的影响。

中国专利文献申请号2020101068312，公开了一种一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用，该专利中公开了随着MTSase的比例增加，海藻糖转化率逐渐提高，在枯草芽孢杆菌中形成MTSase:MTHase＝3:1的多酶复合体转化率最高为81.5％，但是当MTSase:MTHase＝4:1时比MTSase:MTHase＝3:1时的转化率略有降低，是由于多个酶之间的空间结构影响与底物的结合能力造成的；由对比例1、4、5、6的转化率结果可以看出，MTSase的比例决定了转化率的大小，是双酶法转化生产海藻糖过程中的限制性因素；该发明公开的多酶复合体重组菌是枯草芽孢杆菌，产生的多酶复合体为胞外酶，即发酵上清液对海藻糖的转化率，但是该专利文献并未涉及其它重组菌中，多酶复合体的不同比例对海藻糖转化率的影响，以及相同比例的多酶复合体，与结构域SpyTag-SpyCatcher不同的结合方式，对海藻糖转化率的影响，也并未涉及该多酶复合体作为胞内酶对海藻转化率的影响。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种构建自组装表达双酶菌株的方法及应用。

本发明技术方案

一种构建自组装表达双酶菌株的方法，包括如下步骤：

(1)以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增得到MTSase的编码基因treY和MTHase的编码基因treZ，所述基因treY的基因序列为SEQ ID NO.1，所述基因treZ的基因序列为SEQ ID NO.2；以合成的SpyCatcher基因序列为模板，PCR扩增得到SpyCatcher基因，所述SpyCatcher基因序列为SEQ ID NO.3；将SpyTag基因序列直接合成在引物中，所述SpyTag基因序列为SEQ ID NO.4；

(2)将pET28a质粒用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切；将pETDuet质粒用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ进行双酶切；