[发明专利]一种构建自组装表达双酶菌株的方法及应用

权利要求书

1.一种构建自组装表达双酶菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增得到MTSase的编码基因treY和MTHase的编码基因treZ，所述基因treY的基因序列为SEQID NO.1，所述基因treZ的基因序列为SEQ ID NO.2；以合成的SpyCatcher基因序列为模板，PCR扩增得到SpyCatcher基因，所述SpyCatcher基因序列为SEQ ID NO.3；将SpyTag基因序列直接合成在引物中，所述SpyTag基因序列为SEQ ID NO.4；

（2）将pET28a质粒用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切；将pETDuet质粒用限制性内切酶BamH Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切；

（3）利用无缝克隆技术将SpyCatcher基因分别连接到treY基因的C端和N端，然后和双酶切的pET28a质粒连接，得到重组表达质粒pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher；将SpyTag、treZ基因和双酶切的pETDuet质粒连接，得到重组表达质粒pETDuet-SpyTag-treZ；并将得到的重组表达质粒共同转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中得到重组目的表达菌种，即E.coli BL21(DE3)/pET28a-SpyCatcher-treY-SpyCatcher/pETDuet-SpyTag-treZ。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中PCR扩增程序如下：

95℃预变形3 min；95℃变性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30个循环；72℃延伸5 min。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中PCR扩增体系如下：

2×Phanta ® Max Master Mix 25μL，上游引物2.5 μL，下游引物2.5μL，基因模板2.5μL，ddH₂O 17.5 μL。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中质粒酶切体系如下：

pET28a质粒 17μL，ddH₂O 3.5 μL，10×QuickCutBuffer 2.5μL，BamHI 1μL，XhoⅠ1μL；

反应条件:37℃金属浴中反应2 h；

pETDuet质粒 17μL，ddH₂O 3.5 μL，10×QuickCutBuffer 2.5μL，BamHI 1μL，NotⅠ1μL；

反应条件：37℃金属浴中反应2 h。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中treY基因的扩增引物序列为SEQID NO.5、SEQ ID NO.7；

步骤（1）中treZ基因的扩增引物序列为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10；

步骤（1）中SpyCatcher基因的扩增引物序列为SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.14。