[发明专利]一种基于PdCuPt的电化学免疫传感器的制备

权利要求书

1.一种基于PdCuPt的电化学免疫传感器的制备，其特征在于，包括以下步骤：

（1）PdCuPt@Fe-N-rGO的制备：将单独制备的超小型PdCuPt双十二面体纳米立方和Fe-N-rGO纳米片结合；

（2）构建无标记型PdCuPt@Fe-N-rGO的电化学免疫传感器，测定乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag含量，绘制工作曲线。

2.根据权利要求1所述的一种检测乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag的电化学免疫传感器及其制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的PdCuPt@Fe-N-rGO的制备具体如下：

（1）PdCuPt双十二面体纳米立方的制备

在室温下，将10.0 ~ 30.0 mg的Pd(acac)₂，5.0 ~ 15.0 mg的Pt(acac)₂，10.0 ~ 20.0mg的Cu(acac)₂，100.0 ~ 110.0 mg的十烷基三甲基溴化铵，100.0 ~ 110.0 mg的柠檬酸钠加到装有6.0 ~ 10.0 mL混合溶剂（油胺（3.0 ~ 5.0 mL）和N，N-二甲基甲酰胺（3.0 ~ 5.0mL））的50 mL的圆底烧瓶中，将混合物搅拌30 min，然后将圆底烧瓶在180 ℃油浴加热24h，通过用甲苯和乙醇（1:3）混合溶液洗涤和离心（8000 rpm，15 min）循环五次来收集合成产物，收集的产物储存在乙醇溶液中；

（2）GO纳米片的制备

将5 ~ 15 g石墨和3.5 ~ 10.5 g硝酸钠置于烧瓶中，在冰浴搅拌下加入350 ~ 1050mL硫酸，剧烈搅拌下加入10 ~ 30 g高锰酸钾，并将烧瓶在室温下保持6天，然后向混合物中加入硫酸（200 ~ 600 mL，5 wt%），并在98 ℃下保持2 h，当温度降至50 ℃时，加入双氧水（10 ~ 30 mL，30 wt%）终止反应，离心洗涤，收集沉淀并冷冻干燥2天；

（3）Fe-N-rGO纳米片的制备

以制备的GO纳米片为原料合成了Fe-N-rGO，GO在去离子水(2 mg/mL)中溶解，用超声处理3 h，将0.5 ~ 1.5 mL FeCl₃·6H₂O（3 mg/mL）水溶液加入到50 ml GO悬浮液中，再超声处理3 min，液氮冷冻，-60 ℃冷冻干燥72 h，干燥后的样品在NH₃氛围下750 ℃热处理1 h，得到Fe-N-rGO；

（4）PdCuPt@Fe-N-rGO的制备

向10.0 mg制备的Fe-N-rGO加入5.0 ~ 15.0 mL PdCuPt双十二面体纳米立方分散液（1.0 mg/mL），然后将混合物超声1 h，离心后，黑色沉淀物在室温下干燥，然后，将20.0 mg黑色粉末再分散在5.0 mL缓冲溶液（pH=7.4）中。

3.根据权利要求1所述的一种检测乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag的电化学免疫传感器及其制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的构建电化学免疫传感器，具体如下：

（1）将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉抛光成镜面，在无水乙醇中超声清洗干净；

（2）将6.0 µL、1.0 ~ 2.0 mg/mL的PdCuPt@Fe-N-rGO分散液滴加到电极表面，超纯水冲洗，室温下晾干；

（3）将6.0 µL、5 ~ 15 µg/mL的乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag抗体滴加到电极表面，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中干燥；

（4）继续将3.0 µL、1 ~ 2 mg/mL的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；

（5）继续滴加6.0 µL、10 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag溶液，用pH=7.0磷酸盐缓冲液冲洗，4.0 ℃冰箱中干燥，制得一种基于PdCuPt的电化学免疫传感器。

4.根据权利要求1所述的一种检测乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag的电化学免疫传感器及其制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的测定乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag，绘制工作曲线，具体如下：

（1）采用10 mL、50 mmol/L的pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液配制不同浓度的乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag溶液，将6 µL不同浓度的乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag溶液分别滴涂至电极表面，反应0.5 ~ 2 h，晾干后连接至电化学工作站中，分别将电极浸于pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液中测定其氧化还原电流变化，当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50mmol/L的pH=7.0磷酸盐缓冲溶液中注入10 µL、5 mol/L的过氧化氢溶液，记录电流变化；

（2）根据所得电流差值与乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag浓度呈线性关系，绘制工作曲线；

（3）利用工作曲线法，得到待测样品中乙型肝炎病毒表面抗原HBs-Ag的浓度。