[发明专利]一种纯固相合成鲑鱼降钙素的制备方法

说明书

本发明公开了一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，包括(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂、(2)制备还原型鲑鱼降钙素粗品、(3)复性、(4)分离纯化步骤，其特征在于：所述步骤(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂具体为：以氨基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBT/HATU为缩合试剂，在多肽合成柱中依次脱掉Fmoc保护基团，逐个偶联相应的氨基酸，获得去保护的三十二肽树脂；其中，氨基酸偶联步骤中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间。本发明通过分析氨基酸合成难度改变偶联时间可提高合成效率，增加产品纯度，降低生产成本。

技术领域

本发明属于药物固相多肽合成技术领域，具体涉及一种纯固相合成鲑鱼降钙素的制备方法。

背景技术

目前，鲑鱼降钙素的合成方法多是利用Fmoc-策略固相法合成，在Fmoc-RinkAmide MBHA树脂上脱保护与相应氨基酸进行偶联，得到的还原型粗品经弱碱空气氧化法得到鲑鱼降钙素。但由于此肽空间位阻大，合成效率一直很低。在现有的公开中国专利中，比如中国专利(公开号CN104672320A)使用逐一偶联的方式将多种氨基酸片段以及特定保护的氨基酸连接在载体树脂上，并通过碘在树脂上进行氧化，得到纯品鲑鱼降钙素。比如中国专利(公开号CN104177490A)把鲑鱼降钙素分成三段使用片段偶联的方式偶联。比如中国专利(公开号CN105111301A)在易产生杂质的难合成的氨基酸采用片段的方式偶联。

在已有的合成方法中，为了提高合成效率都会采用一些特定保护的氨基酸或是特定的偶联片段，在每个氨基酸偶联的时间都在2小时或4小时左右，这生产过程中务必加大原料的投入以及工艺合成周期长，最终都会增加生产成本。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种鲑鱼降钙素的制备方法，其通过分析氨基酸合成难度改变偶联时间提高合成效率，增加产品纯度，降低生产成本。

本发明通过下述技术方案实现。

一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，包括(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂、(2)制备还原型鲑鱼降钙素粗品、(3)复性、(4)分离纯化步骤，其特征在于：

所述步骤(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂具体为：以氨基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBT/HATU为缩合试剂，在多肽合成柱中依次脱掉Fmoc保护基团，逐个偶联相应的氨基酸，获得去保护的三十二肽树脂；其中，氨基酸偶联步骤中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间。

作为具体技术方案，所述步骤(3)复性具体为：先将还原型鲑鱼降钙素粗品分离纯化，获得还原型鲑鱼降钙素精肽，然后将还原型鲑鱼降钙素精肽通过空气氧化法进行复性，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品。

作为具体技术方案，所述鲑鱼降钙素的制备方法包括如下步骤：

(1)制备降钙素去保护的三十二肽树脂

以氨基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBT/HATU为缩合试剂，在多肽合成柱中依次脱掉Fmoc保护基团，逐个偶联相应的氨基酸，获得去保护的三十二肽树脂；其中，氨基酸偶联步骤中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间；

(2)制备还原型鲑鱼降钙素粗品

于去保护的三十二肽树脂中加入裂解试剂进行切肽，然后加入乙醚沉淀，收集沉淀即获得还原型鲑鱼降钙素粗品；

(3)复性

先将还原型鲑鱼降钙素粗品分离纯化，获得还原型鲑鱼降钙素精肽，然后将还原型鲑鱼降钙素精肽通过空气氧化法进行复性，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品；其中，所述空气氧化法具体步骤为：将还原型鲑鱼降钙素精品溶解并调节pH后，加入H2O2水，振荡反应12～20h，之后离心、过滤，收集滤液，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品；

(4)分离纯化