[发明专利]一种纯固相合成鲑鱼降钙素的制备方法

权利要求书

1.一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，包括（1）制备降钙素去保护的三十二肽树脂、（2）制备还原型鲑鱼降钙素粗品、（3）复性、（4）分离纯化步骤，其特征在于：

所述步骤（1）制备降钙素去保护的三十二肽树脂具体为：以氨基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBT/HATU为缩合试剂，在多肽合成柱中依次脱掉Fmoc保护基团，逐个偶联相应的氨基酸，获得去保护的三十二肽树脂；其中，氨基酸偶联步骤中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间，具体的：

对于鲑鱼降钙素中的难合成氨基酸片段：Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu，根据难合成片段中氨基酸的合成难度系数，设计不同的偶联时间，氨基酸的合成难度系即为通过薛定谔方程计算出的氨基酸和周围氨基酸的相互作用力大小；其中1号位Cys、4号位Leu、6号位Thr、7号位Cys、8号位Val、9号位Leu、11号位Lys、12号位Leu的合成难度系数大于1，偶联时间控制为3 h；2号位Ser、3号位Asn、5号位Ser、10号位Gly的合成难度系数低于1，偶联时间控制为1.5～2 h；对于鲑鱼降钙素中除上述难合成氨基酸片段以外的其它易合成氨基酸片段，其基酸偶联时间均控制为1～1.2 h；

所述步骤（1）制备降钙素去保护的三十二肽树脂的氨基酸偶联过程中，氨基酸逐个偶联的顺序为：

Boc-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Asn(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Pro-Rink Amide Resin；

所述步骤（3）复性具体为：先将还原型鲑鱼降钙素粗品分离纯化，获得还原型鲑鱼降钙素精肽，然后将还原型鲑鱼降钙素精肽通过空气氧化法进行复性，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品；其中，所述空气氧化法具体步骤为：将还原型鲑鱼降钙素精品溶解并调节pH后，加入H₂O₂水，振荡反应12～20 h，之后离心、过滤，收集滤液，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品。

2.根据权利要求1所述的一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）制备降钙素去保护的三十二肽树脂

以氨基树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，以HOBT/HATU为缩合试剂，在多肽合成柱中依次脱掉Fmoc保护基团，逐个偶联相应的氨基酸，获得去保护的三十二肽树脂；其中，氨基酸偶联步骤中，依据各个氨基酸合成难易程度，设计不同的偶联时间；

（2）制备还原型鲑鱼降钙素粗品

于去保护的三十二肽树脂中加入裂解试剂进行切肽，然后加入乙醚沉淀，收集沉淀即获得还原型鲑鱼降钙素粗品；

（3）复性

先将还原型鲑鱼降钙素粗品分离纯化，获得还原型鲑鱼降钙素精肽，然后将还原型鲑鱼降钙素精肽通过空气氧化法进行复性，获得氧化型鲑鱼降钙素粗品；

（4）分离纯化

将氧化型鲑鱼降钙素粗品进行 分离纯化、冻干，获得目标产物氧化型鲑鱼降钙素精肽。

3.根据权利要求1 所述的一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）制备降钙素去保护的三十二肽树脂中氨基树脂为取代度0.32 mmol/g 的Rink AmideMBHA树脂。

4.根据权利要求1 所述的一种固相合成鲑鱼降钙素的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）制备降钙素去保护的三十二肽树脂的氨基酸偶联过程中，Ser、Thr、Tyr 的保护基为tBu，Glu 的保护基为OtBu，Gln 的保护基为Trt，Lys 的保护基为Boc，His 的侧链保护基为Boc，Cys 的侧链保护基为Acm，最终N 端的保护基为Boc。