[发明专利]一种枣花蜂蜜真实性评价方法及应用

说明书

本发明公开了一种新型的枣花蜂蜜真实性评价方法。具体涉及一种利用液相色谱串联质谱检测中蜂蜜中伯胺氧化酶的方法，用于枣花蜂蜜的真实性评价。包括：枣花蜂蜜中伯胺氧化酶的水解之后的特征肽段筛选，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测等步骤。本发明所提出的枣花蜂蜜真实性评价方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，通过准确定量蜂蜜中伯胺氧化酶用于枣花蜂蜜的真实性评价。该方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂蜜消费行业健康发展具有重要现实意义。

技术领域

本发明涉及食品检测领域，具体的公开一种新型的枣花蜂蜜真实性评价方法，主要是采用液相色谱串联质谱定量检测枣花蜂蜜中伯胺氧化酶，用于枣花蜂蜜的真实性评价。

背景技术

蜂蜜是一种天然甜味食品，深受人们喜爱。糖类和水分是蜂蜜中的主要物质，此外，蜂蜜中还含有丰富氨基酸、酚酸、黄酮、微量元素等对人有益的物质。蜂蜜种类繁多，按照蜜源植物的不同，可以分为洋槐、椴树、枣花、荆条、荔枝、龙眼、油菜等单花蜜。其中枣花蜜因味道甘甜、花香葱郁，且具有良好的润肠、补血、调节免疫力和助眠等功效，深受广大女性和老年人的喜爱。枣花蜜是我国北方地区夏季独有的蜂蜜品种，主要集中在山东、河南、河北、和山西等等区域。由于蜜蜂采集枣花蜜时，易于出现一定程度的中毒反应，蜂群群势下降很快，从而导致枣花蜜的产量相对较低。尽管枣花蜜售价显著高于其它种类单花蜜，但是收获的枣花蜜远不能满足市场的需求。不良企业为了追逐高额利润，往往制造和销售掺假的枣花蜜，主要是在枣花蜜蜂蜜中掺入其它种类蜂蜜，更有甚者，掺入大量廉价糖浆，从而扰乱枣花蜜销售市场。如何有效评价枣花蜂蜜的真实性，保护蜂农和消费者权益成为当前蜂产品亟需解决的难题之一。

蜂蜜中含有少量的蛋白质，主要是来源于蜂蜜分泌的王浆主蛋白和酶类等动物源性蛋白，此外，还含有来源于蜜源植物分泌到花蜜中的植物源性蛋白。由于蜂蜜中植物源性蛋白来源的特殊性，可以将其作为蜂蜜种类评价的专属性指标。本研究团队发现枣花蜂蜜中存在大量的伯胺氧化酶(primary amine oxidase，PrAO)，其分子量约为18kDa。枣花花蜜中的PrAO十分丰富，通过蜜蜂的采集行为，迁移并保留在蜂蜜中。PrAO仅仅存在于枣花蜂蜜中，在其它种类的蜂蜜均未发现，具有专属性，是枣花蜂蜜的特有成分。此外，不同产地的枣花蜂蜜中PrAO的含量相对稳定，因此，蜂蜜中PrAO的有无和含量可以作为枣花蜂蜜真实性和纯度评价的关键指标。

发明内容

本发明提供一种检测蜂蜜中伯胺氧化酶的方法及应用于该方法的特征肽段和应用，通过特征肽段对蜂蜜中伯胺氧化酶进行高精度的定量检测，从而解决现有技术中，蜂蜜掺假后难以鉴别的问题。

此方法可用于生产和商业中对枣花蜂蜜的质量控制和真实性鉴定。

第一方面，本发明提供枣花蜂蜜中植物源性蛋白—伯胺氧化酶的鉴定及特征肽段的筛选的方法，包括：

A提取枣花蜂蜜样品中总蛋白，通过SDS-PAGE电泳方法分离、回收PrAO，胶内酶解PrAO并除盐，复溶后进液相色谱串联质谱检测；使用PEAKS Studio软件针对质谱结果进行搜库，查询对比得到PrAO此特异性蛋白；

B从质谱检测结果中筛选PrAO特征肽段以及其序列，人工合成所述特征肽段及对应的稳定同位素内标肽段；

进一步，本发明提供可用于液相色谱串联质谱测定枣花蜂蜜中PrAO蛋白的特征肽段，所述特征肽段选自如下任一个：

i)AGPVISLASIYDR；

ii)AGPVISLASIYDREQGK；

iii)IIPGSLSSISLLSEDDYPQIR。

进一步地，特征肽段i)可作为定量肽段，特征肽段ii)和iii)可作为定性肽段。

第二方面，本发明提供了一种基于液相串联高分辨质谱技术判定蜂蜜是否为枣花蜂蜜并对枣花蜂蜜样本的PrAO的特征肽段的定量方法，具体步骤如下：