[发明专利]一种人脐带血来源的外泌体及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种人脐带血来源的外泌体及其制备方法和用途，通过将差速离心、蔗糖密度梯度和超滤法等方法结合对人脐带血外泌体进行分离纯化；本发明人脐带血来源的外泌体的制备方法以天然存在的人脐带血为原料，无需经过人工的修饰和改造，减少质量及安全性风险，对外泌体的获取更便捷，成本亦更低，易推广，对于进一步充分利用了脐带血资源有重要的意义；另外，相对于通过培养的细胞中获取的外泌体，外泌体中的调控因子成分更丰富，经实验证明，本发明方法提取的外泌体能够有效抵抗内皮细胞和机体衰老，具有巨大的临床和经济价值。

技术领域

本发明属于分子生物学及生物医药、医学保健领域，涉及一种外泌体，具体涉及一种人脐带血来源的外泌体及其制备方法和用途。

背景技术

随着近些年的科学研究发展，脐带血在遗传病、代谢病、免疫治疗及再生医学中的价值受到广泛重视。目前，脐带血的应用主要集中在细胞移植方面，因为脐带血中含有大量的可分化成人体各种细胞的干细胞。脐带血中的干细胞用以治疗疾病的方法日渐显现其重要性。

外泌体(exosome)或者细胞外小囊泡(small Extracellular Vesicles，sEV)是自然存在于生物体液中的30-200nm的细胞外囊泡。外泌体或细胞外小囊泡(sEV)的概念包涵于细胞外囊泡(EV，0-1000nm)的概念之内。几乎所有的细胞均可分泌外泌体(细胞外小囊泡)。因其内包涵大量的RNA、蛋白质等丰富的内容物，外泌体在细胞间或组织间通信和跨物种通信中发挥极其重要的作用。除作为生物标志物外，因其能够保护其有效载荷不受化学和酶降解的影响，并能够逃避免疫系统的识别清除(免疫原性非常低)，故成为无细胞治疗的新型手段。同时，外泌体有别于细胞因子等其他小分子物质，其作为细胞间信息传递的重要媒介，通过进入靶细胞并进一步参与细胞的相关转录、翻译过程，从而起到相应的生物学效应。并非细胞因子等易灭活的体液成分单纯干预所产生的效应。

目前关于外泌体的应用还并没有进入临床使用阶段。现阶段外泌体应用研究前沿主要以通过细胞培养、分泌外泌体的方式获取。但是，培养细胞获取外泌体的方式存在重大缺陷。第一，众所周知，体外培养细胞的性状会随传代而发生变化。因此其分泌的外泌体的性状也会随之发生改变。不同细胞代数分泌的外泌体都是不一样的。而且因为外泌体内含物十分复杂，所以对于培养细胞的外泌体的均一性而言，就目前来说，现阶段的科学技术还没有能力做到满足使用条件的质控。第二，体外细胞培养很难良好地复制机体内外泌体的状态。第三，引入体外培养的步骤，大大增加了人为风险，比如外源细胞因子或血清的引入。

因此，有必要对开发一种提取方便、临床应用价值好的外泌体。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种制备过程简单、安全可控，且临床应用价值更高的外泌体及其提取方法和应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种人脐带血来源的外泌体的提取方法，所述外泌体是指脐带血中大小为30-200nm的细胞外小囊泡，提取方法包括以下步骤：

(1)将脐带血和预冷的PBS按体积比为1：0.5～3混合，

(2)通过差速离心分离得到初步的外泌体混合物1；

(3)将所述外泌体混合物1加入蔗糖垫溶液，通过密度梯度离心分离得到含有外泌体的蔗糖溶液；

(4)收集所述含有外泌体的蔗糖溶液，转移至截留值至少为100kD超滤管中进行超滤，并通过PBS洗涤截留组分；

(5)收集滤网中的截留组分即为所述人脐带血来源外泌体；