[发明专利]一种定量免疫检测方法

说明书

本发明公开了一种定量免疫检测方法，包括以下步骤：（a）在聚苯乙烯微球上包被抗体，制备成检测试剂；（b）将待测样本与检测试剂混合，检测试剂中的微球发生聚集反应；（c）通过粒径仪测量初始和反应后的聚苯乙烯微球粒径和数量，比较粒径范围内微球数量的变化。本发明所述的定量免疫检测方法，灵敏度较高，能够更加准确地测试出待测样本的含量。

技术领域

本发明属于医学检验检测技术领域，具体涉及一种定量免疫检测方法。

背景技术

免疫检测在体外诊断、食品安全等诸多领域的应用非常广泛，在疾病筛查诊断、食品质量控制等方面有着非常重要的意义。免疫检测指利用抗原、抗体特异性结合的方式对目标抗原或抗体进行检测，方法分为乳胶凝集、ELISA等。乳胶凝集又细分为手工法、利用分光光度计读数的胶乳比浊法。ELISA方法又根据所用检测底物的不同，细分为放射免疫、酶联免疫、荧光免疫、发光免疫等等。胶乳比浊法：用特异性抗体标记乳胶颗粒后，将待测抗原与标记好的乳胶颗粒混合，此时乳胶颗粒上的抗体与抗原结合聚集，显著改变了整个液体的浑浊度，通过分光光度计测试液体吸光度的改变，从而计算出待测抗原的浓度。在实际应用的过程中，胶乳比浊法的灵敏度不够高，当胶乳颗粒聚集较少或过多时，通过检测胶乳颗粒凝集前后液体吸光度的变化来间接计算凝集程度就会不准确，不能监控每个胶乳粒子的聚集情况。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种能够显著改善测试灵敏度的定量免疫检测方法。

技术方案：本发明所述的一种定量免疫检测方法，包括以下步骤：

（a）在已经经过羧基化改性过的聚苯乙烯微球上包被抗体，制备成检测试剂；

（b）将待测样本与检测试剂混合，检测试剂中的聚苯乙烯微球发生聚集反应；

（c）通过粒径仪测量初始和反应后的聚苯乙烯微球粒径和数量，比较粒径范围内微球数量的变化。

进一步的，所述微球数量的变化定义为损失粒子比例，等于（初始粒子数量-反应后粒子数量）/初始粒子数量。

进一步的，步骤（a）具体包括：

（a1）微球活化：取已经经过羧基化改性过的、粒径为0.5-3μm的聚苯乙烯微球制备成溶液，再加入EDAC和NHS水溶液，混合后室温静置，高速离心弃去上清液，再将沉淀的聚苯乙烯微球用MES缓冲液重悬；

（a2）交联抗体：将待测样本的抗体交联到（a1）得到的聚苯乙烯微球表面；

（a3）封闭：将（a2）中交联好的微球中加入BSA溶液，搅拌、离心弃去上清液，将沉淀物用MES缓冲液重悬，即制备得到所需检测试剂。

进一步的，步骤（a1）中取已经经过羧基化改性过的、粒径0.5-3μm的聚苯乙烯微球制备成溶液，优选为取已经经过羧基化改性过的、粒径为0.5μm的聚苯乙烯微球制备成浓度为0.1% W/V的溶液。

进一步的，步骤（a2）中所述交联包括通过羧基进行交联和利用物理方式进行吸附，部分抗体通过羧基交联到聚苯乙烯微球表面，部分抗体通过物理方式直接吸附到聚苯乙烯微球表面。

进一步的，步骤（a2）具体为：将待测样本的抗体加入步骤（a1）得到的微球溶液中，25-45℃水浴搅拌3-5小时，高速离心弃去上清液，再将沉淀物用MES缓冲液重悬。

进一步的，配制不同浓度的待测样本标准溶液分别上机测试，得出对应的损失粒子比例，以待测样本标准溶液浓度为X轴，损失粒子比例为Y轴，绘制标准曲线，根据待测样品的损失粒子比例，查曲线得出相应的浓度。