[发明专利]一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒及检测方法，技术方案为：一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒及检测方法，通过引物优化筛选，采用3对通用引物联合检测，利用物种的熔解温度Tm作为特征值建立标准库，可以快速、简便地检测肉及肉制品中黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊、兔、马、驴、猪、狗、猫、鼠、狐、貂、貉15种动物源性成分。本发明简便快速，无需琼脂糖电泳避免了交叉污染，不需要针对每个物种设计相应的特异性引物；借鉴统计学上PCA、LDA的分析方法使得检测结果更加可视化；与传统的多种PCR技术相比，克服了引物之间的竞争问题，大大提高了检测效率，降低了反应成本。

技术领域

本发明属于肉及肉制品安全检测领域，具体涉及一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒及检测方法。

背景技术

随着社会经济的快速发展，受暴利驱使的食品掺假犯罪活动日益增多。近年来，由于欧洲“马肉事件”，沃尔玛“驴肉掺假”等食品欺诈问题层出不穷，引起了人们对肉制品安全的高度重视。

目前我国市场上肉制品掺假按掺假形式主要分为三类，第一类是商家将一些低价肉（猪、鸡、鸭肉）掺杂到高价肉（牛羊肉）当中，经过一些加工处理手段让人难以从感官上分辨出来；第二类是用一些不可食用的肉物种（狐狸肉、貂肉等）进行掺假；第三类是用一些来源不明的物种（鼠肉、猫肉等）进行冒充，这类现象常常出现在流动摊贩，也是行为最恶劣的一种。因此随着掺假物种的种类增多，一种高通量鉴别检测方法对于维护消费者合法权益、保障食品安全以及促进肉类行业的健康发展至关重要。

随着分子生物学的发展，目前针对肉制品中动物源性成分检测方法主要形成了以蛋白检测和DNA分析两个不同的检测方向。由于核酸的稳定性和种间多态性，目前以PCR为基础的检测方法成为肉物种成分鉴别的主流技术。虽然已经有研究建立了多种用于肉及肉制品的PCR检测方法，但通常能够同时检测的动物源性成分数量有限；并且大部分现行标准只是针对单一物种或者相近物种的检测，对于未知物种更是难以鉴别。为了克服这种局限，2018年发布的国家食品安全标准均采用PCR阵列芯片提高可检测物种的种类（GB/T 35917-2018膜芯片，11种；GB/T 35024-2018液相芯片，13种）。但是这些方法大都基于特异性引物，设计引物繁琐复杂；阵列芯片检测需要的流程复杂，并且开管操作容易造成交叉污染，限制了其推广应用。

高分辨熔解曲线技术（high resolution melting analysis，HRM）是2003年由美国Wittwer实验室建立的一项闭管检测基因变异和基因分型的DNA分析技术。它的反应原理主要依赖于PCR完成之后，产物双链DNA在逐渐升高温度下的熔解行为，通过持续检测第三代嵌入性饱和染料的荧光强度值变化，从而获得相应的特异性熔解曲线图谱。经典的熔解曲线一般采用的是不饱和染料，通常监测的熔解温度差异1℃，无法区分序列之间的较小的差异，而HRM分析利用专业化的仪器和数据分析软件以及第三代饱和染料，实现了序列之间细微差异的检测，其可以监测熔解温度差异0.5℃。

发明内容

本发明的目的是要提供一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒及检测方法，采用5对通用引物联合检测，利用物种的熔解温度（Tm）作为特征值建立标准库，可以快速、简便地检测肉及肉制品中黄牛、水牛、牦牛、山羊、绵羊等15种动物源性成分。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种15种动物源性成分的PCR高分辨熔解检测试剂盒，包括5对通用性引物、PCR反应混合液、饱和荧光染料、双蒸水、动物源性成分的基因组DNA及哺乳动物鉴别标准图谱；

所述的通用性引物具体序列为：

97bp对应的引物序列为：

上游引物：5'- CAGACATCTGGTTCTTTCTTCAGGGC -3'；

下游引物：5'-GGGCTGATTAGTCATTAGTCCAT -3'；