[发明专利]一种AHPND致病性副溶血弧菌RPA-LFS快速检测方法的建立及应用

说明书

本发明公开了一种AHPND致病性副溶血弧菌RPA‑LFS快速检测方法的建立及应用，包括引物筛选，引物种间特异性检测，探针设计及筛选，RPA‑LFS种间特异性检测，RPA‑LFS反应温度检测，RPA‑LFS反应时间检测，RPA‑LFS最低检出限测定，引物探针筛选探针长度46bp，探针5’末端用FITC进行标记，3’末端引入3C‑spacer进行末端封闭，在探针中间引入THF，即无嘌呤无嘧啶位点(AP位点)，AP位点前至少要保留30bp的碱基，AP位点之后至少有15bp的碱基，下游引物的5’末端标记生物素，探针和下游引物扩增产物的一端带有FITC，另一端带有生物素。本发明解决设备依赖性问题，解决检测周期长的问题，对操作人员实验技能要求简单。

技术领域

本发明涉及海产品养殖和食品安全领域，尤其涉及一种AHPND致病性副溶血弧菌RPA-LFS快速检测方法的建立及应用。

背景技术

对虾肝胰腺坏死综合征(AHPND)是目前爆发的对对虾养殖产生严重威胁的疾病之一。AHPND最初在中国爆发，随后越南，泰国，马来西亚，墨西哥，菲律宾等国家相继爆发。该疾病致死率高，传播速度快，一旦爆发会导致大量对虾死亡，在对虾养殖产业造成了严重的经济损失。亟需采取科学有效的措施实时监控致病菌的情况，并采取有效措施预防致病菌的爆发和传播。因此，建立一种能够现场快速检测AHPND的方法在预防该疾病的爆发和传播中具有重要意义。

目前，现有的检测AHPND的检测方法主要有AP3，AP4以及LAMP检测方法。AP3检测方法：AP3检测方法是传统PCR检测方法，以AHPND的PirA基因为靶序列设计一对扩增产物为336bp的引物进行检测。该检测技术要经过三个温度阶段，并且其扩增产物需要进行琼脂糖凝胶电泳检测，实验设备要求高且耗时长，因此，该技术技术被局限于实验室研究，不宜做现场检测，为此我们提出一种AHPND致病性副溶血弧菌RPA-LFS快速检测方法来解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的问题，而提出的一种AHPND致病性副溶血弧菌RPA-LFS快速检测方法的建立及应用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种AHPND致病性副溶血弧菌RPA-LFS快速检测方法，包括以下步骤：

1)引物、探针设计及筛选：

上游引物：5’-CATCTTTGACGGAATTTAACCCTAACAAT

下游引物：5’-Biotin-TAACTAAACCTATGTAATGATCTTTTG

探针：5’-FITC-ATGAGCCAGCTATTGATAATATTTGGGAAC[THF]ATTACGTGACTGAAT-SpC3。

2)RPA-LFS种间特异性检测。

3)反应温度。

4)反应时间。

5)RPA-LFS最低检出限测定。

优选地，引物探针筛选探针长度46bp，探针5’末端用FITC进行标记，3’末端引入3C-spacer进行末端封闭，在探针中间引入THF，即无嘌呤无嘧啶位点(AP位点)，AP位点前至少要保留30bp的碱基，AP位点之后至少有15bp的碱基，下游引物的5’末端标记生物素，探针和下游引物扩增产物的一端带有FITC，另一端带有生物素。

一种AHPND致病性副溶血弧菌RPA-LFS快速检测方法的应用，RPA-LFS初步应用检测，从凡纳滨对虾养殖场采取对虾，养殖水共75个样本用RPA-LFS检测方法检测，同时用AP4方法做对标，65个对虾样本中有20个样本检测为阳性，10个养殖水样本中有3个样本检测为阳性，该结果与AP4检测方法一致，符合率为100％。