[发明专利]一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的方法

说明书

本发明提供一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的方法，属于生物学领域，采用所述引物：nifH‑F：5'‑AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC‑3'；nifH‑R：5'‑TTGTTSGCSGCRTACATSGC CATCAT‑3'，构建鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的方法，此方法无需对鉴定样品的微生物进行专门的处理，分离和纯化，可进行免培养的鉴别，本发明所提供的方法有助于快速、准确地鉴定蓝细菌与不同宿主所组成的共生体系中的固氮微生物的分布状况。

技术领域

本发明提供一种利用固氮酶nif基因鉴定满江红叶腔中共生固氮蓝藻的方法，属于生物学领域。

背景技术

水生植物满江红（Azolla），俗称“红萍”，是一种生长在淡水水面的蕨类植物，因富含氮素和蛋白质等营养在我国和亚洲农村被用作绿肥和饲料已有数百年历史。上世纪80年代初，随着国际上可持续农业的兴起，我国对满江红研究予以高度重视。农业部在福建省农科院设立了专门的红萍研究机构，其中“国家红萍资源圃”征集国内外满江红品种资源达200多种。这种细小的植物繁殖快,生物量高，归因于其叶腔中栖息着一种固氮蓝藻，具有将空气中氮气的转化为可供机体使用的氮形式的能力。这种固氮蓝藻是属于革兰氏阴性细菌的光自养原核生物，故又称蓝细菌（cyanobacterium）。满江红与蓝细菌共生关系极为密切，蓝细菌在满江红的有性世代和无性世代中均是以一种全封闭的形式传递的。在无性繁殖中，蓝细菌随满江红枝叶的裂殖而在叶腔增殖传递；在有性世代中，蓝细菌进入满江红雌性孢子果的囊群盖中休眠，而等到宿主雌孢子受精萌发后又同步进入幼苗的叶腔中继续传递。因此，满江红是一个相对封闭的共生体。

长期以来，人们借助显微镜可以观察到满江红的叶腔中共生着的蓝藻是由多个细胞串联成的丝状体，形态酷似念珠藻（Nostoc），其中含有营光合作用的营养细胞和专司固氮的异形胞。异形胞中的固氮酶可将大气氮转化为植物可利用的结合态氮，以NH₄的形态满足宿主生长对氮素的需求。宿主则蔗糖为主的碳源作为回报。

对于固氮微生物来说，固氮酶(Nitrogenase)的合成是由固氮基因(nif)操纵和调节的。固氮酶复合物主要由两部分组成: nifH编码的铁蛋白( 又称为固氮还原酶) 和nifDK编码的钼铁蛋白( 又称为固氮酶)。在固氮菌的基因组中，固氮相关的nif 基因都是作为一个或几个基因簇存在的，称为固氮基因簇( nitrogen-fixationgene cluster) ，是生物固氮的遗传基础。发现几乎所有已测序的固氮菌都至少含有6个保守的基因: nifH，nifD，nifK， nifE， nifN和nifB ，并且这6个基因在所有已鉴定的系统中对固氮都是必需的。蓝细菌门是一类古老的细菌门类，固氮蓝细菌的种类繁多，已知的固氮蓝藻的固氮酶由H、D、K三种基因组成。在通常情况下，D、H两个基因靠在一起，而K基因与它们之间则隔着一段由12000个核苷酸组成的DNA（脱氧核糖核酸）序列。当环境没有氮源时，它的DNA上的这12000个核苷酸会被切下，使K、D、H基因紧挨在一起形成一个独立的操纵子，此时固氮酶就开始显示活力，蓝藻体内的生物固氮‘机器’才开始运转。 由于利用已知的固氮菌nif 基因簇中的共有基因簇的序列可以发现和检测新的可能的固氮菌，本发明以固氮菌中含有的nifH基因簇为基础设计引物，通过直接提取满江红共生复合体的DNA,用PCR方法扩增出固氮酶基因的片段，高通量测序后通过比对细菌数据库中的固氮微生物，从而快速准确地鉴定出固氮蓝细菌的类别。

发明内容