[发明专利]一种寡核苷酸引物、试剂盒及应用

说明书

本发明属于分子生物学检测技术与精准医学领域，具体涉及一种寡核苷酸引物、试剂盒及应用。所述寡核苷酸引物包括具有3’端和5’端的3p臂、发夹环以及具有3’端和5’端的5p臂，5p臂不与DNA模板结合，3p臂与DNA模板杂交，同时提供聚合酶延伸的序列特异性；发夹环位于5p臂和3p臂之间，发夹环包括与DNA模板杂交的单链环与双链茎，寡核苷酸引物与DNA模板结合时，单链环与DNA模板之间的结合能大于双链茎之间的结合能。本发明还提供了一种试剂盒及其在多重PCR中的应用。解决了现有引物特异性低、均一性差及检测灵敏度偏差大，及多重PCR引物二聚体形成、扩增偏好性和错配率高的问题，使多重PCR的效果稳定可靠。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术与精准医学领域，具体涉及一种寡核苷酸引物、试剂盒及应用。

背景技术

随着高通量测序技术的发展，测序成本的降低，其在生命科学及医学领域方面的研究和应用越来越广泛，特别是在疾病诊断及预防中发挥重要作用，其主要表现在产前筛查、肿瘤诊断、重大疾病预防、健康相关宏基因组分析等方面。虽然人类全基因组测序从测序时间和资金花费上已有了巨大的飞跃，但庞大的数据分析和遗传信息提取费时费力，相比较而言，扩增子测序能根据研究者目的，针对目标区域进行高覆盖度的测序，还可以检测到低频突变。采用扩增子测序，研究者可以对基因组中感兴趣的关键区域进行重点研究。这种高针对性的方法可以高效地发现、验证和筛选关注区域的基因组变异。相比全基因组测序，扩增子测序对目标区域有更准确快速的研究，适用于大量样本的特定基因组区域研究，更有利于用于临床疾病检测。

采用高通量基因测序技术检测基因突变，需要进行测序前样本文库的制备。目前测序文库构建的方式主要有两种，一种是使用专门的试剂盒进行的探针捕获法建库，一种是使用扩增子PCR的方式进行建库。其中，使用试剂盒进行建库的优点是标准化程度高，适用性强，可针对各种长度的PCR产物；但缺点是试剂昂贵，操作流程比较繁琐。而扩增子建库则简单、便宜许多，但是目前技术中，扩增子建库方法多为只针对一个单独的靶基因进行扩增建库，如果想对多个不同的靶基因进行一次性建库则需要一个个进行单基因扩增重复或者采用多重PCR，但是多重或超高重PCR方法进行目标区域扩增，可能会存在扩增偏向性、扩增突变等因素导致目标区域扩增不均一，从而对后续测序数据产生偏向性影响。多重PCR的主要限制因素包括引物二聚体的形成、扩增偏好性和错配率高。

为了解决上述问题，现有技术的解决方法之一是利用Omega primer(Ω引物)，Omega primer是由3个功能区段组成：3p臂(3p arm)是聚合酶延伸反应的启动子；5p臂(5parm)是结合DNA模板序列的锚；分隔两臂的环(loop)：用于设计单重PCR的通用引物区。相比于传统引物，OmegaPrimer具有以下特点：大幅提升特异性——omega primer需要3p臂和5p臂同时特异结合模板(template DNA)。具有宽容模板变异的能力。大幅降低引物二聚体。扩增子中容纳更长的真实序列。但Ω引物在扩增时，环状部分并不打开，在解决特异性低、均一性差及检测灵敏度偏差大的技术问题是还有改进的空间。

如上所述，现有技术中仍需要用于大量特异性核酸分子同时多重扩增的方法，所述方法能阻止非特异性引物二聚体的形成，消除靶特异性引物扩增的偏差及PCR扩增本身存在突变所导致的假阳性。

发明内容

1.发明要解决的技术问题

针对现有技术中多重PCR存在扩增偏向性、扩增突变等因素导致目标区域扩增不均一，对后续测序数据产生偏向性影响，且现有技术中Ω引物特异性低、均一性差及检测灵敏度偏差大的问题。本方案提供了一种寡核苷酸引物、试剂盒及其应该方法，解决了现有技术中引物存在的二聚体的形成、扩增偏好性和错配率高的技术问题，使多重PCR的效果稳定可靠。

2.技术方案

为达到上述目的，提供的技术方案为：