[发明专利]一种寡核苷酸引物、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种寡核苷酸引物，包括具有3’端和5’端的3p臂、发夹环以及具有3’端和5’端的5p臂，其特征在于：所述5p臂不与DNA模板结合，所述3p臂与DNA模板杂交，同时提供聚合酶延伸的序列特异性；所述发夹环位于5p臂和3p臂之间，所述发夹环包括与DNA模板杂交的单链环与双链茎，所述寡核苷酸引物与DNA模板结合时，所述单链环与DNA模板之间的结合能大于双链茎之间的结合能。

2.根据权利要求1所述的一种寡核苷酸引物，其特征在于：所述3p臂是从5到15个核苷酸长度；所述5p臂包括UMI序列和通用锚定序列，所述UMI序列是5～10个随机核苷酸N，所述N是A、T、C或G中的任一个。

3.根据权利要求2所述的一种寡核苷酸引物，其特征在于：所述3p臂是从10到15个核苷酸长度；所述UMI序列是7～8个随机核苷酸N，所述N是A、T、C或G中的任一个。

4.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求1～3任一项所述的一种寡核苷酸引物。

5.根据权利要求4所述的一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括利用所述寡核苷酸引物进行多重PCR反应的试剂。

6.根据权利要求5所述的一种试剂盒，其特征在于：所述试剂包括缓冲液、DNA聚合酶和dNTP的混合物。

7.一种利用权利要求4-6任一项所述的试剂盒扩增两个或更多不同靶核酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

提供至少一组特异性引物对，所述特异性引物对包括第一特异性引物和第二特异性引物，且专为特定靶核酸设计；提供至少一组通用引物，所述通用引物包括第一通用引物和第二通用引物；提供一组靶核酸；所述第一特异性引物和第二特异性引物为所述寡核苷酸引物；

进行2～5轮第一热循环过程，该过程包括变性步骤、退火步骤和延伸步骤；

进行10～30轮第二热循环过程，该过程包括变性步骤、退火步骤和延伸步骤。

8.根据权利要求7所述的扩增两个或更多不同的靶核酸的方法，其特征在于：所述第一特异性引物和第二特异性引物终浓度为2nM～100nM；所述第一通用引物和第二通用引物终浓度为400nM～1μM。

9.根据权利要求7所述的扩增两个或更多不同的靶核酸的方法，其特征在于：所述第一特异性引物和第二特异性引物终浓度为5nM～50nM；所述第一通用引物和第二通用引物终浓度为500nM～800nM。

10.根据权利要求7所述的扩增两个或更多不同的靶核酸的方法，其特征在于：第一热循环的变性步骤温度为95℃，时间为15s，退火步骤温度为54℃，时间为30s～5min，延伸步骤温度为72℃，时间为30s；第二热循环的变性步骤温度为95℃，时间为15s，退火步骤温度为60℃，时间为30s，延伸步骤温度为72℃，时间为30s。