[发明专利]一种液态发酵制备莱鲍迪苷A的方法

说明书

本发明涉及一种液态发酵制备莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：（1）糖基转移酶UGT76G1基因接到pUC18质粒载体上，导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，接入LB培养基，30～37°C、200～250 rpm下培养10～18h；（2）按0.1%～10%体积比的接种量接入到种子罐，100～400 rpm，通气比0.2～1 V/V.min，30～37°C下培养5～12 h；（3）按1%～15%体积比的接种量接入发酵罐，100～800 rpm，通气比0.5～2 V/V.min，30～37°C，pH6.6～8.0，培养20～30h；（4）菌体浓度OD₆₀₀达20～60时加入诱导剂，浓度在0.05～1 mmol/L；（5）压滤、重悬、高压均质破碎、压滤得粗酶液；（6）将甜菊糖苷、尿苷二磷酸葡萄糖、磷酸缓冲液、粗酶液混合，25‑40°C反应12‑48 h。本发明优点：酶活性高，可催化底物浓度高，转化率高，发酵过程易控，步骤简单，发酵成本低廉。

技术领域

本发明属微生物发酵酶制剂技术领域，涉及一种液态发酵制备莱鲍迪苷A的方法。

背景技术

甜菊糖（甜菊糖苷）是从甜叶菊干叶中提取的天然甜味剂，甜叶菊中的甜菊苷成分占糖苷总量的 60% ～ 70%，但是甜菊苷有一定程度的薄荷醇味，并且后苦味较为明显，整体的甜味口感不是很好，莱鲍迪苷A约占糖苷总量的 15% ～ 20%，口感较接近于蔗糖，具有较高的稳定性和安全性。甜叶菊糖基转移酶UGT76G1能将甜菊苷转化为莱鲍迪苷A，提高甜菊糖产品的口感，提高产品的市场价值。

近年，随着食品饮料企业对甜味剂口感要求的提高以及对甜味剂成本的加强控制，生物酶方法、发酵方法等制备天然甜味剂甜菊糖的新方法应用而生。现有生物酶方法获得的酶活性低，发酵成本高，收率低，操作复杂，难以工业化生产。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有莱鲍迪苷A生产成本高、酶活性低、操作复杂的问题，提供一种液态发酵制备莱鲍迪苷A的方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种液态发酵制备莱鲍迪苷A的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）种子制备：糖基转移酶UGT76G1基因连接到pUC18质粒载体上，将质粒载体导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，将大肠杆菌接入LB培养基，控制LB培养基温度为30～37°C，转速200～250 rpm，培养时间为10～18h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得大肠杆菌按照0.1%～10%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为100～400 rpm，通气比（每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示，V/V.min）为0.2～1 V/V.min，在30～37°C温度下培养5～12h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照1%～15%体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为100～800 rpm，通气比为0.5～2 V/V.min，在30～37°C温度下，控制pH为6.6～8.0，培养20～30小时，发酵结束得到发酵液；

（4）菌体诱导：当发酵罐生产过程中菌体浓度OD₆₀₀值达到20～60，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，控制异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0.05～1 mmol/L；

（5）将步骤（4）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到大肠杆菌菌体，随后大肠杆菌进行重悬10～20min，0.1～0.5Mp下高压均质破碎得到大肠杆菌破碎液，随后将大肠杆菌破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；

（6）催化体系：将甜菊糖苷、尿苷二磷酸葡萄糖、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比5-10 ：1-2：40-60 ：5-20 混合，随后在25-40°C下反应时间12-48 h即可得莱鲍迪苷A。