[发明专利]一种液态发酵制备莱鲍迪苷A的方法

权利要求书

1.一种液态发酵制备莱鲍迪苷A的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）种子制备：糖基转移酶UGT76G1基因连接到pUC18质粒载体上，将质粒载体导转到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，将大肠杆菌接入LB培养基，控制LB培养基温度为30～37°C，转速200～250 rpm，培养时间为10～18h；

（2）种子罐培养：将步骤（1）所得大肠杆菌按照0.1%～10%体积比的接种量接入到装有LB培养基的种子罐中培养，控制种子罐转速为100～400 rpm，通气比为0.2～1 V/V.min，在30～37°C温度下培养5～12 h，得到种子培养液；

（3）发酵罐生产：将种子培养液按照1%～15%体积比的接种量接入装有发酵培养基的发酵罐中培养，控制发酵罐转速为100～800 rpm，通气比为0.5～2 V/V.min，在30～37°C温度下，控制pH为6.6～8.0，培养20～30小时，发酵结束得到发酵液；

（4）菌体诱导：当发酵罐生产过程中菌体浓度OD₆₀₀值达到20～60，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，控制异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度为0.05～1 mmol/L；

（5）将步骤（4）所得的发酵液采用板框压滤的方法得到大肠杆菌菌体，随后大肠杆菌进行重悬10～20min，0.1～0.5Mp下高压均质破碎得到大肠杆菌破碎液，随后将大肠杆菌破碎液采用板框压滤的方法得到粗酶液；

（6）催化体系：将甜菊糖苷、尿苷二磷酸葡萄糖、磷酸缓冲液、粗酶液按质量比5-10 ：1-2：40-60 ：5-20 混合，随后在25-40°C下反应时间12-48 h即可得莱鲍迪苷A。

2.根据权利要求1所述一种液态发酵制备莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：步骤（1）中LB培养基优选温度为31～36°C，转速220～235rpm，培养时间为13～15h。

3.根据权利要求1所述一种液态发酵制备莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：步骤（2）中种子罐优选转速为220～350 rpm，通气比为0.5～0.8 V/V.min，在31～36°C温度下培养8～10h。

4.根据权利要求1所述一种液态发酵制备莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：步骤（3）中发酵罐优选转速为450～780 rpm，通气比为0.8～1.5 V/V.min，在31～36°C温度下，控制pH为6.8～7.3，培养24～28小时。

5.根据权利要求1所述一种液态发酵制备莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：步骤（4）中异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度优选为0.2～1 mmol/L。

6.根据权利要求1所述一种液态发酵制备莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：步骤（3）中发酵培养基制备方法如下：按照磷酸二氢钾5～10 g、磷酸氢二铵1～6 g、柠檬酸1～10 g、酵母粉2～10 g、葡萄糖5～40 g、微量元素母液1～10 g的比例去配制得到发酵培养基，用氢氧化钠溶液调节pH为6.8～8.0，用去离子水定容至1000 ml。

7.根据权利要求6所述一种液态发酵制备莱鲍迪苷A的方法，其特征在于：所述微量元素母液制备方法如下：按照EDTA-2Na 0.84g、六水氯化钴0.25 g、四水氯化锰1.5 g、五水硫酸铜0.22 g、硼酸0.3 g、钼酸铵0.182 g、硫酸锌1.7 g、柠檬酸铁铵13.75 g 、浓硫酸5 滴的比例去配制，用去离子水定容至1000 ml。