[发明专利]一种简单高效马铃薯多R基因聚合辅助育种方法

说明书

本发明提供一种简单高效马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，具体包括：晚疫病抗性筛选引物序列组RB、R8、Rx1、Ry_adg和GBSS，以及利用该引物组构建多重PCR反应体系对晚疫病持久抗性以及PVX和PVY病毒病抗性基因聚合育种选择。该方法检测的特异性高、对DNA模板的质量和浓度有很好的容忍度，方便适应大规模育种中间材料的分子标记的筛选鉴定。本申请为晚疫病和病毒病多抗基因聚合育种提供了简单高效的技术和多抗新品种的选育提供了技术方案。

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种简单高效马铃薯多R基因聚合辅助育种方法。

背景技术

中国是世界最大的马铃薯生产国，总产量和人均消费量一直稳步增长，马铃薯产业的可持续发展对保障粮食安全和促进区域经济发展具有重要意义。然而，马铃薯生产一直受到病虫害的威胁，严重影响马铃薯安全生产。尤其以晚疫病爆发和病毒积累引起的种薯退化等最为严重，也是限制马铃薯产业发展的主要瓶颈。目前防控晚疫病以化学药剂为主，但由于化学药剂成本以及抗药性和环境安全等问题，使用受到限制。病毒在细胞水平上侵染马铃薯植株，很难用化学药剂防治，生产上主要通过使用脱毒种薯和控制病毒传播媒介(如蚜虫等)来防治病毒病，然而这些防治方法的效果需要严格的组织管理和高昂的投入来保证。马铃薯生产中种植抗病品种仍是防控马铃薯晚疫病、病毒病等最经济有效和环境友好的途径。因此，选育同时抗晚疫病和抗病毒病的品种显得尤为重要，也是目前重要的育种目标。

马铃薯传统育种技术是在双亲杂交产生的子代基础上，进行多代无性世代性状评价和选择，进而培育出优良品系和品种的过程，整个过程耗时长、工作量大、选择效率低(徐建飞与金黎平，2017)。抗病性鉴定是抗病育种的首要工作，常规鉴定方法费时费力，易受环境及人为主观因素影响，且难以对多个抗性同时进行鉴定。在实际育种中，如何在大量群体植株中选择出目标单株是一项艰巨的工作，利用分子标记辅助选择技术可在植株生长的任何时期进行辅助选择，尤其是在抗病育种中人工接种病菌失败或没发病的情况下，更能体现其优越性，被育种家争相应用到育种中(姚姝等，2017)。抗病(R)基因的定位克隆是开发分子标记用于育种辅助选择的基础。越来越多的R基因相继在不同的马铃薯种中发现并定位或克隆，例如已克隆了晚疫病小种特异抗性基因R1、R2、R3a和R3b等，并开发了相应的分子标记应用抗病育种辅助选择(徐建飞和金黎平，2017)。近年来发现，小种特异抗性基因已不断被新进化的小种克服，含有这些R基因的马铃薯品种也逐渐丧失了晚疫病田间抗性，利用小种特异R基因标记辅助选择晚疫病抗性效率也大大降低，广谱抗性基因RB和R8的应用逐渐表现更高效(刘勋等，2019)。在田间条件下有8种病毒和1种类病毒对栽培马铃薯危害较严重，在世界范围内分布也很广泛(聂碧华等，2012)。其中PVY、PVX等表现尤为突出，它们引起马铃薯植株花叶、褪绿、矮缩等症状，特别是复合侵染时可使产量损失高达73.5％，同时还会严重影响块茎品质和商品性(范国权等，2019)。利用分子标记辅助选择进行多基因聚合，需要利用与目的基因分子标记对每个基因进行一次检测，工作量很大，成本高。开发多重PCR检测体系能进一步提高分子标记辅助选择在多基因聚合育种中效率和节约成本。

现有技术存在的问题：现有技术中未见报道能针对晚疫病持久抗性基因RB和R8以及来源S.tuberosum ssp.andigena中的PVX抗性基因Rx1和PVY抗性基因Ry_adg多重PCR的报道。本申请以马铃薯GBSS基因特异引物GBSS-981监控PCR反应体系有效扩增，利用RxAP-1230和RYSC3-321标记以及设计RB-692和R8-1832标记建立了同时检测Rx1、Ry_adg、RB和R8的多重PCR方法体系。结合农艺性状选择，通过该方法体系鉴定出同时含有上述4个R基因标记的高代品系4个。该开发的多重PCR检测体系能高效的辅助选择晚疫病持久抗性以及PVX和PVY病毒病抗性基因聚合育种选择，能广泛的应用马铃薯育种的程序。

发明内容

本发明要解决的关键技术问题在于提供多R基因聚合辅助鉴定马铃薯品种系晚疫病和病毒病抗性。