[发明专利]一种简单高效马铃薯多R基因聚合辅助育种方法

权利要求书

1.马铃薯晚疫病抗性以及PVX和PVY病毒病抗性筛选引物序列组，其特征在于，所述引物序列组包括：(1)RB标记引物如序列表SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；(2)R8标记引物如序列表SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；(3)Rx1标记引物如序列表SEQ ID NO：7和SEQID NO：8所示。；(4)Ry_adg标记引物如序列表SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；(5)GBSS标记引物如序列表SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示。

2.如权利要求1所述的引物序列组在多重PCR体系多基因聚合育种辅助选择中的应用。

3.马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，其特征在于，采用R8、RB、Rx1和Ry_adg的多重PCR检测予以实现，具体如下：(1)材料选择与DNA提取；(2)马铃薯资源材料Rx1和Ry_adg标记检测；(3)引物设计及单R基因PCR检测；(4)PCR产物的克隆与序列分析；(5)多重PCR反应体系的建立与优化。

4.根据权利要求3所述的马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，其特征在于，步骤(1)材料选择与DNA提取，具体为：采集218份马铃薯资源材料DNA用于Rx1和Ryadg单标记检测，出苗4周后取1-2片幼嫩叶片用于DNA的提取。

5.根据权利要求3所述的马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，其特征在于，步骤(2)马铃薯资源材料Rx1和Ry_adg标记检测，具体为：在218份马铃薯资源中检测晚疫病小种特异的R1、R2 family和R3a/b以及持久抗性基因RB和R8标记的组成。

6.根据权利要求3所述的马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，其特征在于，步骤(3)引物设计及单R基因PCR检测，具体为：通过查询GenBank中马铃薯晚疫病持久抗性基因R8和RB基因序列，设计其特异引物，同时设计了马铃薯GBSS基因特异引物，以此监控PCR体系成功扩增。

7.根据权利要求3所述的马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，其特征在于，步骤(4)PCR产物的克隆与序列分析，具体为：将RB和R8的PCR产物进行回收，克隆并测序，进一步验证扩增产物与对应的参考序列是否具有一致性，确定所用引物对的特异性，并对所产生的结果进行数据分析，验证扩增产物与对应的参考序列的一致性。

8.根据权利要求3所述的马铃薯多R基因聚合辅助育种方法，其特征在于，步骤(5)多重PCR反应体系的建立与优化，具体为：将分别含有Rx1和RB以及Ry_adg和R8基因的两个马铃薯基因型等量DNA混合，作为多重PCR反应的模板，建立多重PCR反应体系，之后改变PCR体系中的延伸温度及相应R8引物浓度条件因素进行多重PCR反应体系的优化。

9.马铃薯晚疫病抗性以及PVX和PVY病毒病抗性检测多重PCR反应体系，其特征在于，包括：(1)最佳引物浓度：GBSS、Rx、Ry_adg和RB标记引物浓度0.5μmolL^-1，R8引物浓度1.00μmolL^-1；(2)最佳延伸温度：64℃；(3)最佳退火温度：55℃。