[发明专利]槟榔芋软腐病病害的生防真菌鉴定方法

权利要求书

1.槟榔芋软腐病病害的生防真菌鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.试验材料准备

材料：土样和健康槟榔芋球茎均采自福建省福鼎市贯岭镇河坑村槟榔芋种植田地，选取不同种植地块，其中土样取深度10～15cm的健康槟榔芋植株根际土壤3处各200g，健康槟榔芋球茎5棵，标记后放入装有冰袋的保温箱中带回备用。槟榔芋软腐病病原细菌来源于实验室前期分离鉴定菌株。

S2.真菌的分离纯化

土壤分离真菌：称取10g土壤放入盛有90mL无菌水并有玻璃珠三角瓶中，振荡10min，依次稀释成10^-1-10^-8的稀释液。分别吸取上述稀释液100μL均匀涂于PDA培养基平板上，设三次重复，于28℃恒温箱倒置培养3～5d，每天观察生长情况。

内生菌分离真菌：将健康的槟榔芋球茎洗净后切取成5×5×5cm组织块，75％乙醇浸泡1min，无菌水漂洗，0.1％升汞表面消毒1～2min，无菌水冲洗3次晾干。用无菌刀将消毒后的组织块切成约0.5×0.5×0.5cm的小块，置于有无菌水研钵中研磨成浆，静置10min，将研磨液梯度稀释10～1000倍，分别取100μL涂布到PDA培养基平板上，设三次重复，于28℃恒温箱倒置培养3～5d，每天观察生长情况。

上述方法待长出菌落后，根据菌落形态、颜色等性状将不同的单菌落挑出，采用平板划线法在PDA培养基上进行分离纯化2～3次，直至分离出单菌落，于斜面试管4℃保藏。

S3.离体块茎回接筛选试验

1)槟榔芋组织块材料准备：选取健康槟榔芋球茎，洗净并风干后，切取大小为长3cm×3cm×0.7cm的组织块，75％乙醇消毒30s，0.1％升汞液消毒5min，无菌水充分涤荡5次，再放入有滤纸的无菌培养皿中，备用；

2)菌液的培养：将分离纯化出的生防真菌和软腐病病原细菌分别接种于PDA、NA液体培养基中，真菌于28℃、220r·min^-1摇床培养3d，病原细菌于37℃、220r·min^-1摇床培养8h，备用；

3)离体回接试验：将软腐病病原菌液和待测真菌液以1﹕1混合，用无菌刀和镊子在处理的组织块中央划长1cm、宽1cm、深约0.3cm的十字伤口，接种20μL混合菌液于组织块十字中央。以无菌水接种为阴性对照，软腐病病原菌液接种为阳性对照，设三次重复，置于28℃恒温培养箱培养14d，观察记录；

S4.菌种分子鉴定

用真菌DNA提取试剂盒提取菌株DNA进行PCR扩增，PCR扩增用真菌通用引物。PCR产物委托公司测序，根据测序所得序列经过序列比对筛选出重复菌株，得到独立不重复菌株后构建进化树，确定菌种；

S5.菌株的形态观察

利用插片法培养真菌，将1/3无菌盖片45°插入平板培养基中，于盖片和培养基交界处接菌，28℃恒温培养5d，用棉兰染液染色，对菌落的形态、颜色、质地、边缘特征等进行平板和显微镜观察。

S6.菌株的生长特性筛选

1)菌饼准备：配制PDA培养基，接种真菌至凝固的平板培养基，封口膜密封至置于28℃恒温培养7d后，从外向内打两圈0.5mm菌饼备用；

2)最适pH：配置PDA培养基，用盐酸和氢氧化钠调节pH至5～10共6个梯度，设三个重复，将制备好的菌饼有菌丝面朝下接种到pH不同的固体培养基中央，28℃恒温培养7d，每天观察菌丝的生长状况，用十字交叉法进行菌落直径的数据测量并记录；

3)最适温度：配置PDA培养基，菌饼接种至固体培养基平板中央，分别置于4、20、24、28、32、37、45℃恒温培养7d，设三个重复，每天观察菌丝的生长状况，用十字交叉法进行菌落直径的数据测量并记录；

4)致死温度：菌饼装入加有适量无菌水的离心管，封口膜密封分别至50℃、60℃、70℃水浴锅水浴5min，接种至平板培养基，28℃恒温培养7d，设三个重复，每天观察菌丝的生长状况，用十字交叉法进行菌落直径的数据测量并记录；

5)碳氮源研究：配制碳源试验的基础培养基：NaNO₃ 2.00g、KCl 0.50g、MgSO₄·7H₂O0.50g、K₂HPO₄ 1.00g、FeSO₄ 0.01g、蒸馏水1L、琼脂20.00g，配制氮源试验的基础培养基：MgSO₄·7H₂O 0.50g、FeSO₄ 0.01g、K₂HPO₄ 1.00g、KCl 0.50g、蔗糖30.00g、蒸馏水1L、琼脂20.00g，分别在碳源试验的基础培养基中加入碳源：木糖、乳糖、葡萄糖、淀粉各30g，在氮源试验的基础培养基中加入氮源：蛋白胨、硫酸铵、牛肉浸膏、酵母浸粉各2g，121℃高压灭菌20min，倒平板培养基接菌饼，以无菌水和碳氮源试验的基础培养基作为对照，设三个重复，28℃恒温培养箱培养7d，每天观察菌丝的生长状况，用十字交叉法进行菌落直径的数据测量并记录；

S7.菌种植株田间活体防效试验

培育福鼎槟榔芋活体健康植株，将无菌剪刀用75％乙醇浸泡后，至酒精灯火焰处焙干，冷却后浸入提前摇好的菌液，菌悬液为软腐病原菌液和生防真菌1:1比例混合配置的(浓度约1.0×10⁶～1.0×10⁷cfu·mL^-1)，将沾有菌悬液的剪刀在槟榔芋球茎制造伤口，用针头吸取菌悬液缓慢打至芋头根茎伤口处，用细菌过滤膜密封，覆土并做好标记，使用过的剪刀和针头针筒不重复使用，14d后观察球茎发病情况。