[发明专利]CRISPR支持的多路基因组工程化

说明书

本文描述了用于理性、多路操作开放阅读框(例如，蛋白质文库中)中的染色体或者细胞或细胞群体中染色体的任何区段的方法和载体，其中使用不同的CRISPR系统。

本申请是申请日为2015年2月11日、申请号为201580018819.3、发明名称为“CRISPR支持的多路基因组工程化”的中国专利申请(PCT申请号为PCT/US2015/015476)的分案申请。

相关申请

根据35U.S.C.§119，本申请要求2014年2月11日提交的美国临时申请61/938,608的权益，该申请的全部教导均通过引用并入本文。

背景技术

大的DNA构建体的理性操作是当前合成生物学和基因组工程工作的主要挑战。近年来，已经开发了多种技术来应对这一挑战并提高能生成突变的特异性和速度。此外，适应性突变是进化的核心驱动因素，但其丰度和对细胞表型的相对贡献即使在大部分充分研究的生物中也知之甚少。这在很大程度上可以归因于与观察和重建这些基因型以及将其存在与感兴趣的表型进行关联相关的技术挑战。例如，依赖于随机诱变的基因组编辑方法导致包含许多突变的复杂的基因型，每一个突变的相对贡献难以解析。而且，由于缺乏关于各个突变的信息，难以确定等位基因之间的上位相互作用(epistatic interactions)。

发明内容

成簇规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspersed ShortPalindromic Repeat)(CRISPR)存在于许多细菌基因组中，并已被发现在适应性细菌免疫中发挥重要作用。这些阵列的转录产生CRISPR RNA，它引导CRISPR/cas复合物序列特异性结合至细胞中的DNA靶标，导致基因阻抑或DNA裂解。这些复合物的特异性允许针对菌株工程化的新型体内应用。

本文描述了理性、多路操作开放阅读框内的染色体(例如，以生成蛋白质文库)或在染色体的任何区段中的多个基因的方法，其中使用不同的CRISPR系统。这些方法提供了比先前可用的方法更有效的组合基因组工程化。

扩展CRISPR的多路化(multiplexing)能力提出了当前的一个技术挑战，并且将能够使用这些系统生成高通量格式的理性文库。这样的进展对于力图重构复杂的遗传网络以实现最佳生产的代谢和蛋白质工程领域具有广泛深远的意义。

所述方法包括向细胞中引入CRISPR系统的组件，包括CRISPR关联的核酸酶Cas9和序列特异性指导RNA(gRNA)，从而利用CRISPR系统诱导序列指导的双链断裂的能力导致序列指导的双链断裂。可将CRISPR系统的组件，包括CRISPR关联的核酸酶Cas9和序列特异性指导RNA(gRNA)，引入至细胞中，在一个或多个载体如质粒上编码。DNA重组工程盒(cassette)或编辑寡核苷酸可被理性地设计为包含位于靶基因座内的所需突变以及可被CRISPR系统识别的在靶基因座外部的常见位置中的突变。所述方法可以用于许多应用，包括改变感兴趣的途径。