[发明专利]大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒，所述检测试剂盒包括13套LAMP检测引物，分别为aggR、ast A、bfpB、escV、ipa H、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA特征基因检测引物，每套均包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，成环引物LoopF和LoopB。通过13套LAMP检测引物的交叉使用，可实现各种致泻型大肠杆菌的毒素基因快速分型检测和普通大肠杆菌基因快速检测，采用环介导等温扩增技术，省去了PCR反应的变性、温度循环等一系列繁琐的过程，节省了反应时间，而且灵敏性比常规PCR高10倍以上；无需电泳检测，直接通过观察颜色变化即可区分阴阳性；整个检测过程只需一个水浴锅即可完成检测，既提高了肉眼的识别率，又可直接用于现场疫病的诊断。

技术领域

本发明涉及大肠杆菌检测技术领域，具体涉及大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法及试剂盒。

背景技术

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常被称为大肠杆菌，为人和动物肠道中的正常栖居菌。一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物具有严重致病性。根据其流行病学特征、发病机制及临床特征等，可将致泻性大肠埃希氏菌分为肠致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenic E.coli，EPEC)、肠出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagic E.coli，EHEC)、肠产毒大肠埃希氏菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)、肠侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasive E.coli，EIEC)、肠聚集性大肠埃希氏菌(enteroaggregative E.coli，EAEC)。

致泻大肠埃希氏菌所产生的致病物质主要包括定居因子、黏附素、外毒素以及肠毒素等，不同类型的致泻大肠埃希氏菌的侵袭部位以及产生的致病物质均有差别，可经食物和饮用水在人群中广泛传播，造成严重疫情。对致泻大肠埃希氏菌检测与甄别方法为选择性分离、生化鉴定、血清学鉴定等，实验周期较长，且一般实验室很难拥有完备的大肠杆菌诊断血清。

近年已有研究采用单重PCR、多重PCR，实时荧光PCR，基因芯片等技术对致泻大肠埃希氏菌进行检测，以达到检测其毒力基因、不同致病型别区分的目的，这些方法时效性、高效性及灵敏度都较传统方法有较大改善，但是此类方法加样步骤繁琐，需要专业人员操作，需要电泳检测，荧光PCR及基因芯片用到的仪器又比较昂贵，同时检测时间虽然有缩短，但是仍然需要2-4h或更长时间。

发明内容

本发明的目的在于提供大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，通过设计13套LAMP检测引物，每套LAMP检测引物包括6条引物，通过13套LAMP检测引物的交叉使用，可实现各种致泻型大肠杆菌的毒素基因快速分型检测和普通大肠杆菌基因快速检测。

此外，本发明还提供包括13套LAMP检测引物的试剂盒。

本发明通过下述技术方案实现：

大肠杆菌及6种致病型基因的快速检测方法，包括以下步骤：

步骤1)、13套引物设计：分别下载GenBank中发表的大肠杆菌基因aggR、ast A、bfpB、escV、ipa H、Ita、Itb、pic、stp、sth、stx1A、stx2A和uidA，运用引物在线设计软件PrimerExplorerV4分别设计13套LAMP检测引物；

步骤2)、提取细菌的DNA模板；

步骤3)、将引物、DNA模板与检测试剂制成LAMP反应体系，利用LAMP反应体系对目标序列进行LAMP扩增，进行检测，通过颜色变化判定目标序列的类型。