[发明专利]一种喇叭虫RNA干扰表达载体与构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种喇叭虫RNA干扰表达载体与构建方法及其应用。步骤包括：1)利用质粒pSCTGA的已知序列，获得pSCTGA质粒骨架；2)利用集胞藻PCC6803基因组DNA，通过PCR扩增C‑藻蓝蛋白β亚基的启动子；3)利用质粒L4440，通过PCR扩增质粒的多克隆位点；4)利用PCR扩增获得的DNA片段，通过同源重组的融合PCR和一步克隆法最终构建得到RNAi表达载体pSCT3C。本发明首先利用氯化钙法将含有目的基因的RNAi表达载体转染进大肠杆菌DH10B菌株，然后再采用接合转移方法将其转染进集胞藻PCC6803中，成功获得阳性单克隆藻株后，可通过喂食方式用于干扰天蓝喇叭虫中目的基因的表达。综上所述，本发明方法易行，操作方便，具有应用于其他纤毛虫基因干扰的可行性。

【技术领域】

本发明属于生物技术领域，涉及一种喇叭虫RNAi表达载体的构建方法及应用。

【背景技术】

天蓝喇叭虫是我国较为常见的一种纤毛虫，隶属于原生动物中的纤毛门多膜纲异毛目，广泛分布于全球各地的淡水环境中。细胞形态呈圆锥状或者喇叭状；有一条链珠状大核和许多与大核邻近的小核；细胞前部较宽，有口器；附着器位于狭窄的后部。虫体伸展时体长可达1-2mm，表面的动体条索之间、沿纵轴方向分布着成排的蓝绿色色素颗粒，是淡水水体浮游生物的重要组成部分。不同于模式生物四膜虫，天蓝喇叭虫并不能利用基因枪技术进行基因的转移，也就无法进一步研究基因的功能。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi现象是dsRNA干扰与其互补序列的基因表达的过程，通过给予单细胞生物或多细胞生物特定的dsRNA，可以诱导RNAi选择性降低目的基因在细胞或有机体中的表达。此现象已经发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫和斑马鱼等多种真核生物中，人们也基于这一现象研究了一种反向调控基因表达的遗传学机制。其中，RNAi现象已经在秀丽隐杆线虫中取得良好的研究结果：首先将含有目的基因的RNAi质粒(L4440质粒)转染进大肠杆菌HT115(DE3)，通过IPTG诱导目的基因dsRNA的表达；然后将大肠杆菌喂食于线虫，目的基因的dsRNA可以通过肠道被转移到线虫中；最后发生RNAi过程,抑制目的基因的表达，并且发现RNAi基因表达的表型是可遗传的。1998年，Ruiz等人发现草履虫中存在依赖于同源识别的基因干扰现象，这是首次在纤毛虫中报道了以dsRNA介导的特异性降解mRNA现象。直到2002年，借鉴于秀丽隐杆线虫的RNAi实验方法和结果，Galvani等在草履虫中成功研究了适用于纤毛虫的RNAi实验方法。此后，人们基于大肠杆菌HT115(DE3)的表达系统，构建了不同的RNAi表达载体，应用于其他纤毛虫的基因功能研究，包括游仆虫、尖毛虫、棘尾虫和天蓝喇叭虫。Slabodnick等基于大肠杆菌HT115表达系统，构建了Mob1的RNAi表达载体，最后根据RNAi的细胞表型，成功证明Mob1是一种非对称定位的模式蛋白，在天蓝喇叭虫的发育和再生过程中起到重要作用。RNAi实验方法的可行性解决了喇叭虫基因功能的研究问题。

基于大肠杆菌表达系统，外源基因需要诱导物的诱导才能进行表达，导致表达外源基因dsRNA时间较长、过程复杂。然而，我们发现的另一种模式生物——集胞藻PCC6803。基于集胞藻PCC6803的表达系统，外源基因无需诱导物诱导即可进行表达，可以持续表达外源基因dsRNA。