[发明专利]一种喇叭虫RNA干扰表达载体与构建方法及其应用有效
| 申请号： | 202010434356.1 | 申请日： | 2020-05-21 |
| 公开（公告）号： | CN111471685B | 公开（公告）日： | 2021-12-21 |
| 发明（设计）人： | 缪炜;韦薇;柴小翠;张巨源;张承才 | 申请（专利权）人： | 中国科学院水生生物研究所 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/82;C12N15/65;A01N57/16;A01P7/04 |
| 代理公司： | 湖北天领艾匹律师事务所 42252 | 代理人： | 程明 |
| 地址： | 430000*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 喇叭 rna 干扰 表达 载体 构建 方法 及其 应用 | ||
1.一种喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的一种喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C，其特征在于，包含在序列SEQ ID NO：1中如下位置的元件：
卡那霉素抗性基因：第92-907位；
复制起始点：第1501-1925位；
诱动基因：第1921-4533bp位；
复制起始蛋白：第5044-6721bp位；
正向
多克隆位点：第7531-7715位；
反向
3.权利要求1所述的一种喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A. 利用质粒pSCTGA的核苷酸序列，合成pSCTGA 质粒骨架；
其中，所述质粒pSCTGA 核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
B. 利用引物，以集胞藻PCC6803的DNA为模板，PCR扩增FP
其中，上游引物FP
C. 利用引物，以集胞藻PCC6803 DNA为模板，PCR扩增RP
其中，上游引物RP
D. 利用引物，以质粒L4440为模板，PCR扩增MCS；
其中，上游引物MCS- F核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，下游引物MCS- R核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
E. 分别回收纯化步骤B和步骤D中的DNA片段，共同作为模板，利用上游引物FP
F. 分别回收纯化步骤E和步骤C中的 DNA片段，共同作为模板，利用上游引物FP
G. 分别回收纯化步骤F和步骤A中的DNA片段，通过一步克隆法进行连接，得到RNAi表达载体pSCT3C。
4.根据权利要求3所述的一种喇叭虫RNAi表达载体pSCT3C的制备方法，其特征在于：
所述步骤A中的pSCTGA 质粒骨架包含复制元件、诱动基因和抗性基因；
所述步骤A中pSCTGA质粒骨架通过质粒pSL2680、质粒pTara、质粒RSF1010及质粒pDU1同源重组连接得到。
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