[发明专利]一种基于UPLC/HRMS的代谢组学相对定量分析方法

说明书

本发明属于代谢组学技术领域，涉及一种基于UPLC/HRMS的代谢组学相对定量分析方法。具体而言，该方法主要包括同位素内标混合溶液、标准曲线校正溶液和代谢组学样本溶液的配制，获取标准曲线校正溶液和代谢组学样本溶液的原始质谱数据，对原始数据进行转置和解卷积，鉴定并选择最优同位素内标，拟合线性方程并计算代谢组学样本溶液中代谢物的相对定量结果，完成代谢组学样本溶液中代谢物和差异代谢物的结构鉴定等步骤。该方法仅用高分辨质谱平台即可满足定性和定量的双重需求，定量结果准确，定性结果准确率较高，成本较低，操作简便，适用性广。

技术领域

本发明属于代谢组学技术领域，涉及一种基于UPLC/HRMS的、利用同位素内标的、用于相对定量检测小分子代谢物的方法。

背景技术

代谢组学(Metabolomics)研究生物体系受外源性物质刺激、环境变化或遗传修饰等因素影响后产生的所有代谢应答，并检测代谢应答的全貌及其动态变化，研究对象一般为相对分子质量小于1000的小分子代谢物，以高通量、大规模实验方法结合模式识别、专家系统等计算体系为特征，对生物体内所有代谢物进行定性定量分析，是系统生物学的重要组成部分。

根据研究目的不同，代谢组学可以分为四个层次：代谢物靶标分析(metabolitetarget analysis)、代谢轮廓分析(metabolic profiling analysis)、代谢指纹分析(metabolic fingerprint analysis)和代谢组学研究(metabonomics)，其中代谢物靶标分析和代谢轮廓分析用于定量检测某个或某类特征性代谢物，代谢指纹分析用于定性或半定量分析全部代谢物，代谢组学研究则用于定量分析全部代谢物，但最后一个层次目前尚未能实现。

鉴于代谢组学的研究方法主要是对代谢物进行定性定量分析，其检测手段则以化学分析领域当下的主流技术为主，包括核磁共振(NMR)、质谱(MS)、高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)等。核磁检测技术的优点是样品无需繁琐的前处理，可以实现样品无创性和代谢物种类无偏向性检测，而缺点是相比于质谱检测技术的灵敏度较低，动态范围有限，对含量较低或浓度相差较大的物质难以同时测定；另外，核磁检测技术目前偏向于定性研究，适合于鉴定未知代谢物。而质谱检测技术则具有较高的检测灵敏度，与色谱技术联用后更可以将复杂样本中的代谢物先进行色谱分离再进行质谱检测，减少了基质的干扰，有利于痕量代谢物的检测。

质谱检测技术依赖于代谢物在离子源中发生电离后生成的不同质荷比的带电荷离子，在质量分析器中实现分离和聚焦，从而获得质谱图。根据联用的色谱仪器不同，色谱质谱联用技术可以分为气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)和毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)等。气相色谱-质谱联用技术适合于分析极性小、易挥发和热稳定性较好的代谢物，针对挥发性较低的代谢物需要衍生化预处理，而衍生化过程受水分因素影响较大，且很难反映代谢物在生物样本中真实情况。液相色谱-质谱联用技术适合于分析中等或大极性、中低挥发性或非挥发性和热稳定性较差的代谢物。而根据质谱检测器不同，又可以分为四极杆检测器(单四极杆和三重四极杆)和高分辨率检测器(飞行时间/TOF、轨道离子阱/Orbitrap和傅里叶变换离子回旋共振/FTICR)，其中四极杆质谱适合代谢物的定量检测，高分辨率质谱适合代谢物的定性分析。由于质谱检测技术对于代谢物的化学性质具有明显的偏向性，因此难以利用单独一种检测手段来同时完成定性和定量，需要多平台互补分析才能较为全面地考察代谢物的变化概况。

由于存在上述技术缺陷，目前只能围绕某单一平台开展定性或定量代谢组学检测方法。例如应用GC-MS平台来检测生物样本中的脂肪酸等，利用LC-MS/MS平台来开发靶向代谢物(包括胆汁酸、氨基酸和神经递质等)检测方法，采用高分辨质谱平台来鉴别代谢物的结构。因此，对生物样品中的代谢物进行全面、高通量、高灵敏度的同时定性定量分析仍是代谢组学研究亟需攻克的难点。