[发明专利]一种基因转录区多变区测序方法

说明书

本发明涉及生物医药技术领域，且公开了一种基因转录区多变区测序方法，包括以下步骤：步骤S1：样品检测；步骤S2：文库构建；步骤S3：mRNA的纯化；步骤S4：cDNA合成；步骤S5：末端修复和接头连接；步骤S6：目标转录本处理；步骤S7：配制反应体系；步骤S8：PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，并设置反应程序，对连接产物进行扩增；步骤S9：文库检测：使用检测文库的插入片段范围，同时对文库进行浓度的定量；步骤S10：精准测序。本发明设计的基因转录区多变区测序方法通过新一代高通量测序，大幅度缩减测序数据量，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在特定状态下的目标转录本序列的频率信息，适用不同建库试剂盒。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种基因转录区多变区测序方法。

背景技术

转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构，揭示特定的生物学过程，已广应用于植物候选基因发掘、功能鉴定及遗传改良等领域。随着新一代测序平台的市场化，RNA测序(RNA sequenclng，RNA-Seq)技术已成为了转录组学研究的重要手段之一。

该技术利用新一代高通量测序平台对基因组cDNA测序，通过统计相关Reads(用于测序的cDNA小片段)数计算出不同mRNA的表达量，分析转录本的结构和表达水平，同时发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及编码序列单核苷酸多态性，提供最全面的转录组信息。转录组测序技术流程主要包括样品制备、文库构建、DNA成簇扩增、高通量测序和数据分析，相对于传统的芯片杂交平台，RNA-Seq技术具有诸多独特优势，转录组测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号、更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组的强大工具，因此我们提出了一种基因转录区多变区测序方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的缺点，而提出的一种基因转录区多变区测序方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种基因转录区多变区测序方法，对于目标转录本可以进行精准定性和定量，我们根据目标区域转录本的序列情况，进行引物A设计，设计好后进行实验，包括以下步骤：

步骤S1：样品检测：检测total RNA的浓度、RIN值、28S/18S和片段大小；

步骤S2：文库构建；

步骤S3：mRNA的纯化：取一定量total RNA样品，适温变性打开total RNA的二级结构，并进行纯化，得到mRNA；

步骤S4：cDNA合成：向步骤S3中所述的mRNA中加入提前配制的一链合成反应体系，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA，配制二链合成反应体系，适温反应一定时间，合成二链cDNA；

步骤S5：末端修复和接头连接：配制反应体系，适温反应一定时间，修复双链cDNA末端，配制接头连接反应体系，适温反应一定时间，使接头与cDNA连接；

步骤S6：目标转录本处理：在步骤S5中所述得到的带有测序文库接头的序列进行扩增；扩增时使用我们设计的引物A和3’端测序文库接头进行。

步骤S7：配制反应体系，适温反应一定时间，配制接头连接反应体系，适温反应一定时间，使5’端测序文库接头与S7中的扩增产物链接；