[发明专利]一种基因转录区多变区测序方法

权利要求书

1.一种基因转录区多变区测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：样品检测：检测total RNA的浓度、RIN值、28S/18S和片段大小；

步骤S2：文库构建；

步骤S3：mRNA的纯化：取一定量total RNA样品，适温变性打开total RNA的二级结构，并进行纯化，得到mRNA；

步骤S4：cDNA合成：向步骤S3中所述的mRNA中加入提前配制的一链合成反应体系，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA，配制二链合成反应体系，适温反应一定时间，合成二链cDNA；

步骤S5：末端修复和接头连接：配制反应体系，适温反应一定时间，修复双链cDNA末端，配制接头连接反应体系，适温反应一定时间，使接头与cDNA连接；

步骤S6：目标转录本处理：在步骤S5中所述得到的带有测序文库接头的序列进行扩增；扩增时使用设计的引物A和3’端测序文库接头进行。

步骤S7：配制反应体系，适温反应一定时间，配制接头连接反应体系，适温反应一定时间，使5’端测序文库接头与S7中的扩增产物链接；

步骤S8：PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，并设置反应程序，对连接产物进行扩增；

步骤S9：文库检测：使用检测文库的插入片段范围，同时对文库进行浓度的定量；

步骤S10：精准测序：富集好转录本多变区的大量序列，进行精准测序。

2.根据权利要求1所述的一种基因转录区多变区测序方法，其特征在于，所述步骤S1中，通过使用Agilent 2100Bioanalyzer检测total RNA的浓度、RIN值、28S/18S和片段大小。

3.根据权利要求1所述的一种基因转录区多变区测序方法，其特征在于，所述步骤S3中，通过使用oligo-dT磁珠对total RNA进行纯化。

4.根据权利要求1所述的一种基因转录区多变区测序方法，其特征在于，所述步骤S5中，在扩增目标转录本时，加入的5’端测序引物是根据物种和目标转录本序列特性设计合成。

5.根据权利要求1所述的一种基因转录区多变区测序方法，其特征在于，所述步骤S6中，修复双链cDNA末端时，在3’末端加上A碱基。

6.根据权利要求1所述的一种基因转录区多变区测序方法，其特征在于，所述步骤S8中，检测文库选用Agilent 2100Bioanalyzer。

7.根据权利要求1所述的一种基因转录区多变区测序方法，其特征在于，所述步骤S8中，通过使用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对文库进行浓度的定量。