[发明专利]一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用，建立方法的步骤如下：(1)制备具有梯度孔径结构的三维间隔织物，三维间隔织物的间隔层的纤维或纱线的排列规律为V字型、X字型或灵活变化型；(2)配制生物活性材料溶液，并将其与三维间隔织物在模具中复合后进行预冷冻和冷冻，制得支架预构体；(3)对支架预构体进行真空干燥，制得复合支架预构体；(4)对复合支架预构体进行交联处理，制得复合多孔支架；(5)将复合多孔支架与肿瘤细胞共培养，制得体外三维肿瘤细胞抗药模型；应用为：用于药物敏感性检测。本发明的建立方法简单，能够制备力学稳定且尺寸均一的三维培养模型，以满足体外细胞培养、抗肿瘤药物筛选等的需要。

技术领域

本发明属于肿瘤细胞三维培养领域，涉及一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用。

背景技术

采用传统二维培养模拟生命系统的最主要缺点是细胞只能单层培养，该条件下培养环境中的氧气、营养物质和信号分子的分布与真实生理环境不符合，不能准确反映细胞—细胞外基质、细胞—细胞间的相互作用。在过去的几十年中，随着三维细胞培养技术的出现，在癌症及再生医学领域已经出现大量关于三维细胞培养模型的研究。在研究肿瘤细胞与微环境中细胞外基质及其他细胞间的相互作用时，开发和利用三维培养模型是不可或缺的。

现在常用的肿瘤细胞三维培养模型构造方式主要有多细胞肿瘤球体模型(multicellular tumor spheroids，MCTS)及三维支架培养模型。多细胞肿瘤球体模型制作方法多样，通常是利用在低粘附或不粘附表面的条件下培养的细胞悬液，经由聚集和压实作用后制备而成。这种模型目前在商业上已经实现半自动化生产，广泛应用于高通量药物筛选领域，但是该技术制备的多细胞球体尺寸不均一，在一定程度上限制了这种模型的应用。为实现真实的细胞相互作用，亦有研究使用仿生材料和结构，构建类似肿瘤细胞生长微环境的三维支架，利用支架培养细胞形成肿瘤细胞集落。研究人员已经开发了多种支架材料，包括天然生物材料(如纤维素、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、或海藻酸盐)、合成生物材料(如聚己内酯、聚乙烯)和无机材料(如陶瓷、钛)。

在应用时，上述材料通常被加工为水凝胶型，或经3D打印及冷冻干燥成单一支架型。如中国专利CN109022342A介绍了一种以手性水凝胶作为贴壁细胞培养的三维培养体系，采用海藻酸钠、透明质酸钠、壳聚糖等物质作为促凝剂而建立的贴壁细胞三维培养体系，该三维培养体系拥有良好的生物相容性，能最大程度的模拟体内生物环境，但是由于细胞被固定于手性水凝胶支架中，细胞活性不高，细胞生长量仅提高20～40％。支架也是一种常用的构建肿瘤细胞三维培养模型的方法，如中国专利CN104312975B介绍了一种三维胶原支架，将三维胶原支架置于培养基中浸泡进行预处理，再将成球的胶质瘤干细胞种植于预处理三维胶原支架中，加入内皮培养基共培养若干天后即得到用于研究胶质瘤干细胞血管拟态的体外三维培养模型，该模型孔径直径为300～500μm，在共培养期间能较好维持细胞的活性，但是由于胶原支架本身力学性能较差且会发生降解，因此不能长时间的维持细胞的高度活性。

已有研究者关注到支架的力学性能并介绍了力学性能有所改善的支架，如中国专利CN106676074A公开了一种多孔纤维素支架，该支架刚度为5～100kPa，可诱导肝癌细胞向肝癌干细胞转化并对肿瘤药物有一定的抗敏感性，但是该纤维素支架形状大小并不能保持高度统一，尺寸并不一致，在应用时会出现数据差异。因此，急需开发一种新型的能够有效制备具有力学稳定、尺寸均一性能的三维培养模型的技术，以满足体外细胞培养、抗肿瘤药物筛选及再生医学的需要。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法和应用。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种体外三维肿瘤细胞抗药模型的构建方法，步骤如下：