[发明专利]抑制宝华玉兰初代培养内生菌污染的培养方法及培养基

说明书

本发明公开了一种抑制宝华玉兰初代培养内生菌污染的培养方法及培养基。本发明所述的培养方法，包含预处理，所述预处理为将外植体浸没于100‑200mg/L硫酸新霉素的无菌水溶液中，浸没时间为12‑36h，所述外植体为宝华玉兰当年生萌蘖枝条。本发明采用宝华玉兰当年生萌蘖枝条为外植体，通过外植体无菌处理后，将外植体接种于初代培养芽诱导培养基上，置于合适的温度、湿度和光照强度条件下进行培养，诱导芽的萌发。本发明的抑菌率达到100％，芽诱导率100％，死亡率为0，褐化率为0，且丛生芽生长健壮。

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养繁殖方法，特别涉及一种抑制宝华玉兰初代培养内生菌污染的培养方法及培养基。

背景技术

宝华玉兰(Magnolia zenii Cheng)为木兰科木兰属玉兰亚属落叶乔木，根据IUCN最新评估标准该种属于极危(Critically endangered,CR)物种。宝华玉兰的树干挺拔通直，可作为良好的木材；其花大芳香，是珍贵的园林观赏树木，且花果可入药，宝华玉兰种子总提取物能够发挥抗炎和抗肿瘤作用。宝华玉兰的天然更新困难，如果不及时采取措施解决宝华玉兰更新困难的问题，将有灭绝的危险。目前虽然已经建立了宝华玉兰的自然保护区和国家森林公园，但针对宝华玉兰的组织培养快速繁育技术开展的工作较少，利用宝华玉兰种子进行有性繁殖，由于其自然繁殖率低，使得大部分野生资源尚未得到有效开发和利用，采用植物组织培养的方法可以有效地解决木兰科植物繁殖困难的问题。

木兰属植物组织培养研究才刚刚起步，而宝华玉兰的组织培养尚未见报道，木兰属植物和大部分木本植物同样面对内生菌污染严重的问题。木本植物中生长年限长，生长环境复杂，普遍存在内生菌。研究表明宝华玉兰根系内普遍存在内生菌，当采用常规灭菌方法开展植物组织离体培养时，常规方法仅能杀死表面病菌，而无法杀死内生菌，此时内生菌就会导致宝华玉兰的外植体出现严重污染，直接导致初代诱导的失败，进而导致无法建立宝华玉兰组织培养高频再生体系，进而影响宝华玉兰种苗的快速繁殖以及宝华玉兰遗传工程等科研进程。因此开发出安全有效的内生菌抑制方法是宝华玉兰组织培养的关键环节。

发明内容

发明目的：本发明提供了一种抑制宝华玉兰初代培养内生菌污染的培养方法。本发明还提供了该方法中采用的培养基。本发明解决了宝华玉兰初代培养中外植体内生菌污染的问题。

技术方案：本发明所述的一种抑制宝华玉兰初代培养内生菌污染的培养方法，包含预处理，所述预处理为将外植体浸没于100-200mg/L硫酸新霉素的无菌水溶液中，浸没时间为12-36h，所述外植体为宝华玉兰当年生萌蘖枝条。

本发明所述的抑制宝华玉兰初代培养内生菌污染的培养方法，为采用宝华玉兰当年生萌蘖枝条为外植体，通过外植体无菌处理后，将外植体接种于初代培养芽诱导培养基上，置于合适的温度、湿度和光照强度条件下进行培养，诱导芽的萌发。

在本发明的一个实施方式中，芽诱导培养基包含浓度为300-500mg/L硫酸新霉素。

在本发明的一个实施方式中，所述芽诱导培养基为MS培养基，还包含以下组分：6-BA含量为0.5-2mg/L,NAA含量为0.1-0.5mg/L,活性炭含量为2-5mg/L，硫酸新霉素含量为300-500mg/L，琼脂含量为7g/L，蔗糖含量为30g/L，培养基pH调至5.8-6.0。

在本发明的一个实施方式中，所述培养方法包括外植体消毒处理，所述植体消毒处理为将经过前期处理的宝华玉兰的枝条叶片剪掉，长条先剪成5-8cm短枝条，经过洗衣粉清洗，流水冲洗2-4h，将外植体转到无菌操作台上，先用75％酒精消毒30-40秒，再用0.1％升汞消毒8-10分钟，再用无菌水冲洗6-8次后，剪成1-2cm长带芽茎段。

在本发明的一个实施方式中，所述培养方法包括接种，所述接种为将带芽茎段接种于芽诱导培养基上。