[发明专利]一种ELISA检测试剂盒的构建方法、试剂盒及应用

说明书

本发明属于标志物及其检测技术领域，公开了一种ELISA检测试剂盒的构建方法、试剂盒及应用，进行包被液1L配制，10XPBST洗液1L配制，1X PBST洗液1L配制，封闭液配制，抗体稀释液配制，McIvain`s buffer配制，显色液配制，0.5M磷酸盐缓冲液配制。本发明验证EGFR能够引起机体产生免疫反应并使机体产生相应的自身抗体，成本低、特异度高、敏感度强、准确性高、无创伤，可以作为早期肺癌的诊断生物标志物，用于区别肺癌患者和正常人，对不同类型肺癌患者与正常对照组进行鉴别；EGFR自身抗体对早期肺癌亦具有诊断价值，可与临床指标CEA联合进而提高肺癌诊断准确性。

技术领域

本发明属于肺癌诊断的标志物及其检测技术领域，尤其涉及一种ELISA检测试剂盒的构建方法、试剂盒及应用。

背景技术

目前，肺癌是最常见恶性肿瘤之一，是全世界发病率与死亡率最高的恶性肿瘤，每年约有180万新的肺癌病例发生，约占全部癌症诊断的13％。近年来发病率呈现升高趋势，肺癌起病隐匿并且早期无明显临床症状、病程发展快，通常确诊时已为中晚期而错过最佳治疗时机，预后较差。目前临床主要联合影像学和“金标准”病理细胞技术诊断肺癌，由于早期确诊率和灵敏度低、费用高、有创等缺点均不适合肺癌早期的筛查诊断。因此，在癌症早期就表现出来异常的生物标志物受到高度重视。目前，临床上用于肺癌检测的标志物有CA125(糖抗原125)，CEA(癌胚抗原)，NSE(神经元烯醇化酶)，CYFRA211(细胞角蛋白19片段)等，这些指标主要用于肺癌预后评价和术后监测，对于肺癌诊断的灵敏度和特异性不高，所以至今尚无理想的可用于早期肺癌的诊断标志物。

癌症发生后，肿瘤相关抗原能够激活人体的细胞和体液免疫反应，产生相应的自身抗体，这些激活人体免疫系统的抗原称为肿瘤相关抗原(Tumor associated antigens,TAAs)。但是，肿瘤相关抗原在血清中易被清除或降解，所以对肺癌早期诊断敏感性较低。与之相反，针对肿瘤相关抗原的自身抗体能够在肿瘤患者血清中稳定存在并可以在出现症状数月甚至数年之前就可以被检测到,因此，肿瘤相关抗原自身抗体，是发展无创血清学检测、诊断和早期检测癌症的理想标志物。与传统的抗原类标志物相比，自身抗体肿瘤标志物有天然的高特异性与免疫生物放大信号等独特优势，已经成为肿瘤早期诊断临床应用技术的发展趋势。杭州凯保罗生物科技有限公司推出了七种自身抗体检测试剂盒(酶联免疫法)用于肺癌检测，但该产品主要应用于肺结节患者甄别良恶性，但是不足之处在于凯保罗试剂盒并不能达到很高的灵敏度和特异度且成本较高，不适合大批量应用于肺癌早期筛查和诊断，目前临床尚无用于肺癌早期检测的自身抗体诊断标志物。

因此，为了能够提高肺癌早期诊断率和提高肺癌患者的生存率，需要研发新的灵敏度和特异度更高的自身抗体标志物，替代或联合现有传统标志物，从而提高肺癌的准确性。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有临床上使用传统的肿瘤标志物常用于肺癌预后评价和术后监测，不能用于肺癌的早期诊断。已报道的用于肺癌诊断的自身抗体对肿瘤诊断的灵敏度和特异度普遍偏低，对肺癌诊断意义不大，不适用于大批量应用于肺癌早期筛查和诊断。

解决上述技术问题的难度：到目前为止，还未有理想的可供临床使用的肺癌早期筛查和诊断标志物。研发一种新的灵敏度和特异度较高的自身抗体标志物，需要经过大样本量的试验和验证，以及运用正确的统计学分析方法和流行病学指标对标志物的诊断价值进行评价，以上都需要严谨的实验设计，配套的仪器设备和深厚的专业知识背景。

解决上述技术问题的意义：发现一种新的可用于在肺癌早期时诊断的自身抗体，提前发现肿瘤不但可以以减少后期癌症病人的痛苦，还可以降低病人后期治疗的经济负担，并达到临床对肿瘤“早发现，早治疗，早康复”的要求，此外，将自身抗体和临床指标联合大大提高了临床指标对肺癌诊断的灵敏度和特异度。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种一种ELISA检测试剂盒的构建方法、试剂盒及应用，旨在解决现有肺癌肿瘤标志物不理想的问题，提高肺癌早期诊断的灵敏度、特异度和准确性。