[发明专利]非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸及方法

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，包括PVC底板，及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫为包被有兔抗鸡IgG-胶体金复合物的胶体金垫，所述硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和ASFV重组抗原包被的检测线。

2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体金试纸，其特征在于，所述检测线包括2种ASFV重组抗原。

3.一种如权利要求1-2任一所述的非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备纯化的ASFV重组抗原；

(2)制备硝酸纤维素膜：将山羊抗兔IgG和纯化的ASFV重组抗原分别稀释后，包被在硝酸纤维素膜的质控线和检测线上；

(3)制备胶体金；

(4)胶体金标记兔抗鸡IgG：取兔抗鸡IgG，将胶体金与兔抗鸡IgG混合，离心，用PBS溶液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgG-胶体金复合物；

(5)制备胶体金垫：将兔抗鸡IgG-胶体金复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获得胶体金垫；

(6)样品垫的处理：将样品垫浸泡在20mmol/L的PBS缓冲液中2-5小时，并且边震荡边混匀，其中缓冲液中加入活化剂；浸泡结束后，将样品垫放入烘箱中烘干；

(7)组装：在干燥环境下，将样品垫、胶体金垫、包被好的硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴在PVC板上，裁切后，获得试纸。

4.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括制备2种纯化的ASFV重组抗原ASFV-1和ASFV-2，步骤包括：根据已知的ASFV N-1、N-2蛋白基因序列制备ASFV N蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌进行发酵表达并离心获得菌体，将菌体超声破碎，离心后取上清，将上清液过亲和层析柱，即为纯化的ASFV-1重组抗原。

5.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，山羊抗兔IgG和纯化的ASFV重组抗原分别以25-80mmol/L的Tris缓冲液稀释至终浓度为1mg/ml，再以0.75μL/cm的喷量喷施包被在质控线和检测线上，充分干燥。

6.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，制备胶体金的方法为柠檬酸三钠还原法，步骤包括：

(Ⅰ)取质量分数为0.005％-0.015％的HAuCl₄水溶液100ml，加热煮沸；

(Ⅱ)迅速加入质量分数为0.5％-5％的柠檬酸三钠水溶液1ml，继续煮沸，溶液由淡黄色变成灰色，继而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，制成胶体金溶液。

7.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体试纸的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，胶体金标记兔抗鸡IgG的步骤包括：

(i)取兔抗鸡IgG溶于0.1-0.2ml 10mM的缓冲液中，将胶体金溶液的pH值调至7.2；

(ii)每20-50mg兔抗鸡IgG中，加入10ml胶体金溶液；

(iii)混合3-5min后，加入质量分数为0.05％的BSA，室温作用结合15min；

(iv)先2000r/min低速离心15min，再12000r/min高速离心25min；

(v)用100mmol/L的pH7.8的含0.2％质量分数Proclin300的缓冲液重悬沉淀，获得兔抗鸡IgG-胶体金复合物。

8.根据权利要求3所述的非洲猪瘟病毒N蛋白IgY抗体检测胶体试纸的制备方法，其特征在于，缓冲液为Tris缓冲液、PBS缓冲液或Hepes缓冲液。