[发明专利]猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体检测免疫荧光试纸及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸，包括PVC底板、及依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其特征在于，所述结合垫为包被有兔抗鸡IgY-荧光微球复合物的兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫，所述硝酸纤维素膜上设有由山羊抗兔IgG包被的质控线和猪蓝耳病毒GP5重组抗原包被的检测线；

所述猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸的制备方法包括以下步骤：

(1)制备纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原；

(2)制备硝酸纤维素膜：将山羊抗兔IgG和纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原分别稀释后，包被在硝酸纤维素膜的质控线和检测线上；

(3)荧光微球标记兔抗鸡IgY：将500μL的荧光微球溶液与100μL的0.5mg/ml的兔抗鸡IgY混合，室温反应3h；然后加入10μL10％BSA封闭微球表面未结合的位点，封闭反应2h；4℃10000rpm/min离心10min；弃去上清游离的抗体，用200μL准备好的稀释液重悬复合物，即兔抗鸡IgY-荧光微球复合物，并于4℃保存；

(4)制备结合垫：将兔抗鸡IgY-荧光微球复合物均匀喷在结合垫上，充分干燥，获得兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫；

(5)试纸条的组装。

2.根据权利要求1所述的一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸，其特征在于，步骤(1)制备纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原的步骤包括：根据已知猪蓝耳病毒GP5蛋白基因序列，制备猪蓝耳病毒GP5蛋白的大肠杆菌重组菌，将重组菌发酵表达并离心获得菌体，将菌体破碎，离心取上清，将上清过亲合层析柱，即为纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原。

3.根据权利要求1所述的一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸，其特征在于，步骤(2)制备硝酸纤维素膜的步骤包括：山羊抗兔IgG和纯化的猪蓝耳病毒GP5重组抗原分别以10mM的PB缓冲液稀释至终浓度为1mg/ml，再以0.7μL/cm的喷量喷施包被在质控线和检测线上，充分干燥。

4.根据权利要求1所述的一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸，其特征在于，步骤(4)的兔抗鸡IgY-荧光微球复合物在结合垫上的喷量为5μL/cm。

5.根据权利要求1所述的一种猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体免疫荧光检测试纸，其特征在于，步骤(5)的试纸条的组装方法的步骤包括：在干燥环境下准备好样品垫、兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫、包被的硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水垫，硝酸纤维素膜下缘粘贴兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫，兔抗鸡IgY-荧光微球结合垫下缘粘贴样品垫，完成后将试纸板切成条状。

6.一种利用如权利要求1所述的荧光检测试纸检测猪蓝耳病毒GP5蛋白IgY抗体的方法，其特征在于，步骤包括：将检测试纸平放，取待测血清样品50μL，加入样品垫，室温静置15min后，在紫外光的照射下根据以下情况判定结果：

试纸有效：在质控线出现绿色荧光线，即说明本试纸有效；

阴性：只在质控线出现绿色荧光线，在检测线不出现色线；

阳性：在质控线和检测线均出现一条绿色荧光线；

且荧光强度与GP5 IgY抗体含量成正比，即GP5 IgY抗体含量越高，荧光强度越深。