[发明专利]一种大规模、高通量、高安全性干细胞库的构建方法

说明书

本发明提供了一种大规模、高通量、高安全性干细胞库的构建方法，该构建方法主要包括以下步骤：S1：将干细胞悬液灌装于麦管内进行非玻璃化冻存；S2：将内置有冻存后的干细胞混悬液的麦管放置于埋伏式恒温金属浴中进行复苏。本发明提供的大规模、高通量、高安全性干细胞库的构建方法具有以下技术效果：本发明将本领域常用于玻璃化冻存方法的麦管应用于非玻璃化冻存，配合埋伏式恒温金属浴复苏方法，能够显著提高复苏时间和复苏的均匀度，大幅度提高复苏后干细胞的存活率、复苏率和回收率等指标，实现了非玻璃化冻存的快融原则，最大限度保持细胞复苏后的活性。

技术领域

本发明属于干细胞领域，特别涉及一种大规模、高通量、高安全性干细胞库的构建方法。

背景技术

干细胞库为三级管理，即初级干细胞库(种子干细胞库)、主干细胞库及工作干细胞库。

初级干细胞库(Pre-master Cell Bank，PCB)：初级细胞又名细胞种子(cellseed)，指来源于单一个体的组织或细胞，经过一定方式培养而成的、并经鉴定性质均一的细胞群体。初级干细胞库是指分装于一定数量、并在一定条件下贮存初级细胞的容器集合。初级干细胞库的贮存细胞经检定合格后可用于制备主干细胞库。

主干细胞库(Master Cell Bank，MCB)：由初级干细胞库的细胞培养至特定倍增水平或传代水平，经一次制备获得的、性质均一的细胞群体，分装于一定数量，并在一定条件下贮存的容器集合。主干细胞库的贮存细胞经检定合格后可用于制备工作干细胞库或细胞制剂。

工作干细胞库(Working Cell Bank，WCB)：由主干细胞库的细胞经培养至特定倍增水平或传代水平，并经一次制备获得的、性质均一的细胞群体，分装于一定数量，并在一定条件下贮存的容器集合。工作干细胞库的贮存细胞经检定合格后可用于制备细胞制剂。

在干细胞库建设过程中，完成高质量的细胞制备后，如何有效的长期稳定保存细胞尤为重要，故：细胞冻存技术作为干细胞库建设的核心技术。

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤，常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器。

按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化冻存和玻璃化冻存两种。

玻璃化冻存法是指利用各种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法，以这种方法冻存的细胞悬液没有冰晶的形成；玻璃化冻存法对细胞活性的保存具有较好的效果，其存活率可达90％以上，不要复杂的仪器设备，具有液氮储存设备即可使用，因为玻璃化冷冻保护液中的冷冻保护剂的浓度较高，室温下对细胞具有毒性(但在4℃时毒性大为减弱)。所以，冷冻保护液的滴加全过程必须在4℃冰浴中进行，另外，滴加速度要缓慢，如果滴加速度过快，则在细胞外产生很高的渗透压，造成细胞膜的损伤，导致细胞死亡，故要缓慢滴加，让冷冻保护剂有足够的时间缓慢渗透到细胞内，达到细胞内外的平衡，目前，该方法已在胚胎干细胞冷冻方面得到广泛应用，但很少应用于一般细胞的冻存，这可能与需要配制较复杂的冻存液以及冷冻前和复苏后较烦琐的操作有关。

非玻璃化冻存是用各种温级的冰箱将干细胞分阶段降温至-70℃到-80℃，然后直接投入液氮进行保存，或者是利用计算机程控降温以及利用液氮的气、液，按一定的速率从室温降至-100℃以下，再直接投入液氮的保存方法，这种冻存方法也能获得较高的细胞存活率。

目前细胞冻存最常用的仍是非玻璃化，目前市售的冻存管主要用于非玻璃化法的细胞冻存技术；市售的麦管主要应用于玻璃化法的细胞冻存技术，且主要应用于生殖细胞的冻存与复苏领域。

发明内容