[发明专利]一种检测细菌中高丝氨酸内酯类物质信号分子的方法

说明书

一种检测细菌中高丝氨酸内酯类物质信号分子的方法，其包括以下步骤：(1)制备含有传感菌的生物传感器平板；(2)将待测菌株或所述待测菌株的培养物上清液接种于所述生物传感器平板；以及，(3)测定所述生物传感器平板是否响应及其响应时间。所述传感菌是根癌农杆菌A136。本发明的方法省去活化、传代与提取上清液的步骤，将待研究的细菌直接接种在传感器平板上，代替常规的向平板上滴加细菌培养基上清液的方法，尤其适合用于检测低活性细菌的AHL。该方法一方面简化了前处理过程，另一方面能够减少出现假阴性的概率。

技术领域

本发明属于细菌微生物检测技术领域，具体涉及一种使用生物传感器和液相色谱-质谱联用仪检测细菌中高丝氨酸内酯类物质信号分子的方法。

背景技术

20世纪70年代，人们在研究海洋细菌费氏弧菌(Vibrio fischeri)的过程中，发现多种细菌能够分泌并感应某种化学分子，协同调控整个菌群的生物发光过程。随着相关研究的不断深入，人们在越来越多的革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌中观察到了类似的现象，并将其定义为细菌通讯(Bacterial communication)，也称作群体感应(Quorum sensing)。

细菌通讯调控细菌诸多生化行为，包括细菌活性，生长和团聚等，使菌群在恶劣环境条件下迅速做出反应，这种反应包括对营养物质的获取、与其它微生物之间的竞争等。在由多种微生物组成的群落中，那些拥有细菌通讯系统的微生物往往能够具有一定优势。

细菌通讯释放的信号分子大概可以分为四类。其中，存在于革兰氏阴性菌中的高丝氨酸内酯类物质(Acyl homoserine lactone；AHL)是目前研究最多、最为透彻的一类信号分子，用于细菌种内通讯。

判断某种纯细菌或某个混合菌群是否具备合成并分泌AHL的能力是研究其受AHL调控行为的基础。使用生物传感器和液相色谱-质谱联用仪(liquid chromatograph-massspectrometer，LC-MS)对细菌培养基上清中AHL的定性分析与定量检测是目前的主要方法。其中，生物传感器可以在某一类AHL存在的条件下，释放出某种可以被检测到的信号，这种信号包括生物荧光、显色、化学物质的产生等，其成本低廉且反应敏感(检测限一般为pM-nM)但难以定量分析且一般不能区分不同侧链的AHL。LC-MS可以鉴别并定量具有不同侧链结构的AHL，但相较生物传感器检测限较高(nM)且成本昂贵。因此，经常将两种方法结合使用以鉴定细菌是否具备分泌AHL的能力及分泌AHL种类。

通常，上述检测方法的检测对象是细菌培养基的上清液，且检测前需要完成一系列的前处理步骤：包括对待检测细菌的活化、传代培养至一定密度，将培养基离心以分离获得上清液。对于检测限较低的生物传感器，可直接使用上清液进行定性分析；对于检测限较高的生物传感器及LC-MS，一般需对上清液进行浓缩处理后再进行检测。

由于需要鉴定的细菌时常取自于抑制因素众多的复杂生态系统或低温冷冻于甘油中，因此活性较差。对于低活性或生长缓慢的细菌，菌种的活化和传代培养会耗费较长时间，上清液中AHL浓度过低则会导致传感器响应时间延长，甚至在不浓缩处理上清液的情况下无法检出，导致定性检测中出现假阴性，对定量检测结果造成误导，不利于对AHL的快速定性与定量检测。

细菌周围存在微环境，即使在混合充分的匀质培养基中，化学物质亦可能存在梯度。研究表明，产AHL细菌周围的微环境中AHL浓度往往高于培养基环境，可能存在在培养基中检测不到AHL但细菌微环境中存在AHL的情况。因此，若可以使生物传感器与待研究细菌直接接触，使其存在于待研究细菌的微环境中，则可能进一步降低生物传感器的检测限，提高定性检测准确度。

发明内容

本发明的目的在于解决生物传感器耦合LC-MS方法定性/定量检测低活性细菌AHL耗时长、前处理复杂、易出现假阴性的问题。