[发明专利]一种重组毕赤酵母及其构建方法和在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用

说明书

本发明提供了一种重组毕赤酵母及其构建方法和在高效制备15α‑左旋乙基甾烯二酮中的应用，属于发酵工程技术领域；本发明以毕赤酵母为宿主，首次以胞内产酶方式同时诱导15α‑甾体羟化酶和葡糖‑6‑磷酸脱氢酶，采用毕赤酵母全细胞边诱导边催化的方式实现左旋乙基甾烯二酮转化高投料量和高转化率。

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，特别涉及一种重组毕赤酵母及其构建方法和在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用。

背景技术

甾体类药物是一类重要的，具有广泛的药理和生理活性的药物，在抗炎、抗过敏、抗肿瘤和生育控制等方面具有极其重要的作用。孕二烯酮是第三代强效避孕药主要成分之一，是迄今为止最为理想的口服避孕药。

孕二烯酮的化学合成需要利用昂贵的催化剂Pb(OAc)₂和Bu₃SnOMe，成本较高且污染较大。微生物转化因其高区域性、立体选择性以及环境友好性在甾体化合物工业中得以广泛应用。15α-左旋乙基甾烯二酮是合成孕二烯酮的关键中间体，目前工业上主要利用雷斯青霉(Penicillium raistrckii)甾体羟基化酶的特异性酶促反应，在左旋乙基甾烯二酮的C15位引入羟基来获得15α-左旋乙基甾烯二酮。

雷斯青霉转化左旋乙基甾烯二酮的15α-羟基化反应在实际工业生产中存在投料量偏低(2g/L)，转化时间(72h)长等问题，严重限制了15α-左旋乙基甾烯二酮的转化率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组毕赤酵母及利用重组毕赤酵母高效转化左旋乙基甾烯二酮的方法，本发明解决了左旋乙基甾烯二酮投料量低的技术问题，实现了孕二烯酮中间体15α-羟基左旋乙基甾烯二酮的高效生产。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母是在毕赤酵母基因组中插入有雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH和酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1；

所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH插入毕赤酵母基因组His4位点；

所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1插入毕赤酵母基因组5’AOX1位点；

所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了上述方案所述重组毕赤酵母的构建方法，包括以下步骤：

S1.将雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH插入到pPIC3.5K中，得到第一重组质粒；

S2.将酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1插入到pPICZ中，得到第二重组质粒；

S3.将所述第一重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化和所述第二重组质粒经限制性内切酶Sac I进行线性化后，电击转化毕赤酵母，得到重组毕赤酵母；

所述步骤S1和S2之间没有时间顺序限制。

优选的，所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH在pPIC3.5K中的插入位点为EcoR I和NotI；所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1在pPICZ中的插入位点为EcoR I和Xba I。

优选的，步骤S3中所述毕赤酵母包括毕赤酵母GS115。

本发明还提供了上述方案所述重组毕赤酵母在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用，包括以下步骤：

1)将所述重组毕赤酵母接种于种子培养基，进行种子培养，至菌液OD₆₀₀为11～13，得到种子液；