[发明专利]一种重组毕赤酵母及其构建方法和在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用

权利要求书

1.一种重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母是在毕赤酵母基因组中插入有雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH和酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1；

所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH插入毕赤酵母基因组His4位点；

所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1插入毕赤酵母基因组5’AOX1位点；

所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述重组毕赤酵母的构建方法，包括以下步骤：

S1.将雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH插入到pPIC3.5K中，得到第一重组质粒；

S2.将酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1插入到pPICZ中，得到第二重组质粒；

S3.将所述第一重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化和所述第二重组质粒经限制性内切酶Sac I进行线性化后，电击转化毕赤酵母，得到重组毕赤酵母；

所述步骤S1和S2之间没有时间顺序限制。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述雷斯青霉甾体羟化酶基因PRH在pPIC3.5K中的插入位点为EcoR I和Not I；所述酿酒酵母葡糖6-磷酸脱氢酶基因ZWF1在pPICZ中的插入位点为EcoR I和Xba I。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中所述毕赤酵母包括毕赤酵母GS115。

5.权利要求1所述重组毕赤酵母在高效制备15α-左旋乙基甾烯二酮中的应用，包括以下步骤：

1)将所述重组毕赤酵母接种于种子培养基，200r/min，28～30℃下进行种子培养，至菌液OD₆₀₀为11～13，得到种子液；

2)将所述种子液接种至发酵培养基，于28～30℃、溶解氧含量值高于20％的条件下，进行发酵培养，至发酵体系中甘油耗尽；

3)在所述发酵体系中甘油耗尽后，以19.92mL/(L·h)的速率向发酵体系中流加微量元素甘油水溶液，至溶解氧含量低于20％时停止流加，继续进行发酵培养至甘油再次耗尽，在甘油耗尽的条件下，菌体保持饥饿状态1h；所述微量元素甘油水溶液包括体积百分含量为45％～55％的甘油和12mL/L的微量元素水溶液；

4)在所述菌体保持饥饿状态1h后，溶解氧含量为100％，以3.61mL/(L·h)的速率向发酵体系中第一次流加微量元素甲醇溶液，至溶解氧含量低于20％时停止流加，于28～30℃的条件下，进行第一诱导培养2h；以7.22mL/(L·h)的速率向发酵体系中第二次流加微量元素甲醇溶液2h；

5)在第二次流加微量元素甲醇溶液2h后，以10.89mL/(L·h)的速率向流加左旋乙基甾烯二酮甲醇溶液，至发酵体系中左旋乙基甾烯二酮的浓度为8g/L，控制溶解氧含量始终高于20％，于28～30℃的条件下反应直至左旋乙基甾烯二酮完全转化；

步骤2)中所述发酵培养基以水为溶剂，包括以下组分：85％磷酸26.7mL/L、CaSO₄ 0.93g/L、K₂SO₄ 18.2 g/L、MgSO₄ 7.27 g/L、KOH 4.13g/L、Tween80 0.6mL/L、甘油40g/L和体积百分含量为0.43％的微量元素水溶液；所述发酵培养基的pH值为5.0；

步骤4)中所述微量元素甲醇溶液是以甲醇为基础，还包括12mL/L的微量元素水溶液；

步骤5)中所述左旋乙基甾烯二酮甲醇溶液是以甲醇为基础，还包括12mL/L的微量元素水溶液和4～5g/L的左旋乙基甾烯二酮；

所述微量元素水溶液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，NaI0.08g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，NaMoO₄·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃ 0.02g/L，CoCl₂ 0.5g/L，ZnCl₂20.0g/L、FeSO₄·7H₂O 65.0g/L、生物素0.2g/L和硫酸5.0mL/L。