[发明专利]惰性载体间接凝集试验检测系统及其应用

说明书

本发明公开了惰性载体间接凝集试验检测系统及其应用，所述间接凝集试验检测系统包括惰性载体菌S9和在其表面展呈表达和携带P抗原因子的复合体S9‑P。该惰性载体间接凝集试验检测系统仅携带P抗原因子，成分单一，特异性靶向，与鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染鸡的全血或血清在一定浓度条件下产生肉眼可见的阳性颗粒凝集反应，而与非鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染的不同背景鸡源血清、全血不出现非特异性交叉凝集反应。该S9‑P基于玻板凝集反应操作平台，操作简便，反应灵敏快速，凝集反应颗粒肉眼可见，结果清晰易判，在两分钟内完成测试和结果判定，该S9‑P适用于鸡群中鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染的靶向特异性检测，在鸡群的现场监测和诊断中具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物医学和免疫诊断检测技术领域，具体涉及惰性载体间接凝集试验检测系统。该间接凝集试验检测系统包括惰性载体沙门氏菌S9表达和携带单一抗原因子P建立的新型惰性载体间接凝集试验鸡白痢和/或鸡伤寒沙门氏菌检测系统S9-P。

背景技术

鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)感染引起鸡和火鸡等禽类的细菌性传染病，主要危害三周龄以内雏鸡，死亡率高，成年鸡感染后无明显症状，但可通过种蛋源垂直传播于后代雏鸡，是危害我国养鸡业的重要疾病，鸡伤寒沙门氏菌(Salmonellagallinarum)感染引起鸡和火鸡等禽类的细菌性传染病，也是危害我国养鸡业的重要疾病，我国已将鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌病列为二类动物疫病，鸡白痢也是世界动物卫生组织(OIE)规定为必须通报的动物疫病之一。鉴于这两种病原菌病原特性具有种源垂直传播的特征，集约化养鸡场一旦发生上述疫病会造成巨大的经济损失。鸡群一旦感染，药物难以清除和根治，而病原分离鉴定费时繁琐和耐药菌普遍存在，在临床工作中防治难度很大，因而对该疾病防控最根本的策略只有通过种鸡群的有效监测和根除净化，目前我国已将种鸡场沙门氏菌净化工作列入《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中。

事实上，鸡白痢、鸡伤寒感染检测方法众多，值得注意的是，基于血清学诊断方法中的平板凝集反应为经典的检测方法，由于其圈栏边鸡舍内鸡全血样品检测的便捷和实用性，同时考虑其廉价、时效性和现场规模化筛选检测适用性，具有无可比拟的诊断应用优势。其原理是细菌颗粒性诊断抗原结合相应的血清抗体后，当有电解质存在、温度适宜时，抗原颗粒和相应特异性抗体结合，出现相互凝集凝聚现象，形成凝集小块或颗粒，仅需通过肉眼就能现场观察和判定结果。我们将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。操作时将凝集诊断抗原与含有相应特异抗体的血清或全血各滴一滴于洁净的透明玻璃平板上，等体积轻轻混合后，室温下2分钟内观察和判定反应结果，如出现肉眼可见的颗粒状凝集现象，即为阳性凝集反应。凝集试验适用于病原感染的快速诊断，具有众多优点，如：简便快捷、不需要任何额外(实验室)仪器、成本低廉且可在圈栏边鸡舍内仅需一滴鸡血现场测试等。尽管该凝集抗原检测已经有多年的实践应用，但是在实际应用中也逐渐暴露出存在的局限性和技术瓶颈制约，如目前国内应用最广泛的商品化鸡白痢、鸡伤寒凝集抗原的检测诊断中，被报道存在多种非特异性交叉反应，由于全菌抗原的交叉非特异性因素导致假阳性率高；基于菌体O抗原固有的O不凝集性因素影响，各批次检测结果稳定性不佳和重复性不理想；此外，O抗原寡糖抗原性相对较弱，检测鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染鸡全血、血清凝集反应的敏感性瓶颈制约而导致漏检，也注意到该方法仅对成年鸡群(种鸡开产前16周龄)检测相对敏感，对雏鸡则可能存在较大的检测误差。前期研究数据中，专利申请发明人所在实验室使用传统的商品化凝集抗原，分两次在不同时间检测同一批来自某种鸡场200份血清时发现，两批的检测结果总符合率仅为81％，提示每批次检测结果并不稳定，前后一致性不佳。当与荷兰Bio Chek公司的沙门氏菌D群ELISA试剂盒对比检测结果时发现，检测结果总符合率仅为79.5％，阳性符合率(检出率或特异性)为75.2-79.4％，阴性符合率(敏感性)为79.5-85.5％。上述检测结果和比较分析表明，该商品化凝集抗原检测鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染血清、全血抗体时，敏感性、特异性、重复稳定性和结果准确性均有提升的空间和必要性，临床上迫切需要改进现有的凝集试验检测方法，旨在达到较为理想的检测水平。