[发明专利]一种用于检测β-地中海贫血的PCR试剂及试剂盒

说明书

本发明提供一种用于检测β‑地中海贫血的PCR试剂及试剂盒，该PCR试剂通过采用高耐受性直扩PCR酶对β‑地中海贫血检测全血样品进行扩增，无需提取样品中的基因组DNA，利用该PCR试剂获得的检测试剂盒，缩短了检测人员整个检测时间，大大节约了时间成本，同时因为减少了DNA提取和纯化过程，减少了影响检测准确性的因素，大大提高了检测结果的准确性。

技术领域

本发明涉及生物医药诊断领域，尤其涉及一种用于检测β-地中海贫血的PCR试剂及试剂盒。

背景技术

β-地中海贫血是由血红蛋白四聚体形式的β珠蛋白合成减少或合成缺乏引起的，根据临床症状和血液学特征分为：β-地中海贫血携带者状态，中间型地中海贫血和重型地中海贫血。β-地中海贫血的携带者状态是由β-地中海贫血的杂合性引起的，在临床上无症状，并由特定的血液学特征定义。重型地中海贫血是严重的输血依赖性贫血，中间型地中海贫血严重程度从无症状携带者状态到严重输血依赖性贫血类型。

β-地中海贫血在分子水平上是异质的。迄今为止，已经鉴定出200多种致病突变。大多数突变是导致移码的寡核苷酸的单核苷酸取代、缺失或插入。中国人群中有5种常见的突变，以CD17(A→T)，-28M(A→G)、CD41/42(-TTCT)、IVS-II-654(C→T)、CD71/72(+A)居多，占所有突变类型的90％。由于某些人群中β珠蛋白基因突变携带率高，故胎儿遗传到β珠蛋白突变基因的概率也高。随着科技的发展，通过早期分子诊断以及遗传咨询和产前诊断，可以使具有生育风险的夫妇对其生育选择做出明智的决定。

β-地中海贫血的传统检测方法有血常规参数检测分析、红细胞渗透脆性试验、血红蛋白电泳试验等，这些检测方法的特异性不高，较易产生假阴性。随着生物技术的发展，诞生了一些特异性高的分子诊断方法，例如TaqMan探针技术、寡核苷酸探针杂交、变性高效液相色谱技术、多重连接酶依赖的探针扩增技术、基因芯片等，但是这些技术均需要提取外周血、绒毛、羊水中的DNA，DNA的质量是PCR成功的一个非常关键的因素，直接影响后续试验。而提取与纯化DNA时极易受污染，使得检测结果易出现假阴性或者假阳性，且DNA的提取和纯化时间约1-2h，检测过程耗费时间长。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种用于检测β-地中海贫血的PCR试剂；本发明的另一个目的在于提供一种用于检测β-地中海贫血的试剂盒。本发明使得在β-地中海贫血检测过程中免去DNA提取和纯化过程，提高了检测结果的准确性，并且节约检测耗费时间。

一方面，本发明提供一种用于检测β-地中海贫血的PCR试剂，包括高耐受性直扩PCR酶，缓冲液，dNTP混合物，PCR增强剂，以及用于扩增待检测样品中β珠蛋白基因片段的PCR引物，所述β珠蛋白基因片段含有与β珠蛋白基因突变探针发生特异性杂交的DNA序列。

在一些实施例中，PCR引物包括两对引物，分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQID NO.3和SEQ ID NO.4。

在一些实施例中，所述PCR增强剂包括二甲基亚砜、甘油、甲酰胺、氯化四甲铵、谷氨酸钾和硫酸铵。

在一些实施例中，所述PCR引物的终浓度为0.4μm-0.8μm。

另一方面，本发明提供一种用于检测β-地中海贫血的试剂盒，包括上述用于检测β-地中海贫血的PCR试剂，以及用于检测β-地中海贫血的核酸杂交膜条和杂交试剂。

在一些实施例中的，所述用于检测β-地中海贫血的核酸杂交膜条包括一尼龙膜基底，以及固定于所述尼龙膜基底上的β珠蛋白基因突变探针和对应的β珠蛋白基因正常探针，所述β珠蛋白基因突变探针选自SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.21中的至少一个DNA序列或其反向互补序列，所述β珠蛋白基因正常探针选自SEQ ID NO.22～SEQ ID NO.32中的至少一个DNA序列或其反向互补序列。