[发明专利]羟氯喹治疗玫瑰痤疮的模型构建方法

权利要求书

1.羟氯喹治疗玫瑰痤疮的模型构建方法，其特征在于：包括以下步骤，

S1、选用7周大小的BALB/C实验鼠；

S2、随后将小鼠随机分为四组，分别为A组阴性对照组、B组羟氯喹处理组、C组玫瑰痤疮模型组和D组LL37加羟氯喹治疗组；

S3、对每组的造模时间均为一周，其中A组给予100μlPBS灌胃7天，B组给予100μlHCQ溶液灌胃连续7天，最后两天A、B组同时进行PBS皮内注射；C组给予100μlPBS灌胃7天，D组给予100μlHCQ溶液灌胃7天，最后两天C、D组同时予以LL37皮内注射；

S4、造模完成24小时之后，收取小鼠背部皮肤，将剪下的背部皮肤分别进行-80℃、液氮冷冻处理以及组织固定液中保存；

S5、对冷冻处理完成后的组织进行样本化处理，其中-80℃冷冻的组织进行免疫荧光和免疫组化检测，液氮冷冻的组织用来提取RNA，组织固定液中的用以HE或甲苯胺蓝染色；

S6、最后用新生鼠的肥大细胞构建体外的玫瑰痤疮细胞模型，并在体外进行验证，对比治疗效果。

2.根据权利要求1所述的羟氯喹治疗玫瑰痤疮的模型构建方法，其特征在于：所述S1中采用的小鼠为BALB/C小鼠，S3中任意组注射的LL37每次注射50μL，每日间隔12小时一次，连续注射两天。

3.根据权利要求2所述的羟氯喹治疗玫瑰痤疮的模型构建方法，其特征在于：在步骤S4中，将每一组的小鼠背部皮肤都剪下四块，一块放入于冻存管中置于液氮冷冻以备RNA提取；一块铺平贴于锡箔纸放置于-80℃冰箱冷冻，以备冰冻切片使用；两块铺平面贴于滤纸，放置于装有通用性组织固定液的1.5ml EP管中用以HE或甲苯胺蓝染色。

4.根据权利要求3所述的羟氯喹治疗玫瑰痤疮的模型构建方法，其特征在于：所述S6中肥大细胞培养和建模方法如下；

选取刚出生2-3天的胎鼠，酒精擦拭身体，减去头部和四肢取皮，取胎鼠皮肤经含有5X、2X、1X双抗的PBS溶液中清洗过后，在生物安全柜中用剪刀将其剪碎；

之后，取适量细胞分离液悬浮剪碎的皮肤组织，置于15ml离心管中，然后放置于37℃震荡箱中160转/分，震荡消化60分钟，待消化完毕后，用等量的含血清的培养基终止消化，然后经过8mm的分子筛滤过细胞；

含有细胞的浑浊液经800转/分离心10分钟后，弃上清，然后加入适量红细胞裂解液轻轻吹打混匀，静置5分钟裂解红细胞，之后再用800转/分离心5分钟，弃上清，用培养基重悬细胞后放入悬浮细胞培养皿中进行培养。

5.根据权利要求4所述的羟氯喹治疗玫瑰痤疮的模型构建方法，其特征在于：培养基选用肥大细胞完全培养基，培养基的成分含有500μl三抗，其中三抗包括100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.25mg/ml两性霉素B，500μl非必需氨基酸100mmol/L，500μl丙酮酸钠100mmol/L，500mol/Lβ-巯基乙醇，10mg/mL重组鼠IL-3，10mg/mL重组鼠SCF和10％的胎牛血清；培养环境和时间为37℃、5％CO₂，连续培养14天。

6.根据权利要求5所述的羟氯喹治疗玫瑰痤疮的模型构建方法，其特征在于：随后对肥大细胞进行纯化，将原代的肥大细胞培养14天后，取培养皿中悬浮细胞，800转/分、5分钟离心重悬后加入到40％的percoll分离液(经过聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒混悬液)(60％培养基加40％等渗percoll分离液)，1600转/分、10分钟离心，弃上清并取最下层的细胞，即为原代皮肤肥大细胞，可用甲苯胺蓝染色鉴定细胞成熟度。

7.根据权利要求6所述的羟氯喹治疗玫瑰痤疮的模型构建方法，其特征在于：皮肤肥大细胞建模将2×10⁶的肥大细胞置于30mm细胞培养皿中，模型组给予4μm的LL37刺激6小时；干预组给予10μm的HCQ或300nm的TRAM-34提前处理肥大细胞1小时，然后给予4μm的LL37刺激6小时；同时也需设置药物对照组，给予10μm的HCQ或300nm的TRAM-34，而空白对照组不给予任何处理，收集细胞RNA，置于-80℃冰箱中保存。