[发明专利]一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法

说明书

本发明公开了细胞培养技术领域，具体领域为一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法，其方法包括取样、清洗消毒和皮肤处理等步骤，使用胶原酶与DNA酶Ⅰ的双酶组合，可使组织块适度消化，可以避免消化后离心带来的细胞损伤，提高细胞活率及贴壁率，又可避免传统贴壁法细胞培养周期较长的缺陷，使用HPL(人血小板裂解提取物)替代FBS(胎牛血清)在较大程度上提高临床应用的安全性，本方法无需去除表皮层，而是将表皮层贴壁培养以获得更高产的细胞，利用差速消化法纯化目的细胞。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体领域为一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法。

背景技术

人皮肤成纤维细胞是组成皮肤真皮的主要结构成分，其可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维、透明质酸等细胞外基质，对于保持皮肤强度和弹性、修复损伤及美容美体具有重要作用。是维持皮肤年轻态的决定性因素，也是维持皮肤结构稳定的重要组成部分。人随着年龄的增长，成纤维细胞数量和活性均呈下降趋势，相应的其产生的胶原蛋白、弹性纤维、透明质酸等物质会逐渐减少，不足以支撑皮肤结构，导致真皮层变薄，皮肤开始出现松弛、失去弹性和出现皱纹等现象。补充人皮肤成纤维细胞能够从根源上解决面部损伤及缓解皮肤衰老等问题，因此而备受医疗及美容界的关注。

现有分离纯化皮肤成纤维细胞的方法主要是组织块培养法和酶消化法，组织块培养法主要是将新鲜皮肤组织洗净、剪碎、离心，然后用培养基重悬培养；酶消化法主要是将新鲜皮肤组织洗净、剪碎、胰酶消化、清洗，然后利用培养基重悬细胞进行培养。以上两种方法存在如下缺点：

1、传统成纤维细胞培养方法中使用酶消化后再离心收集细胞接种，对细胞有较大损伤，会导致原始种子细胞贴壁效率较低，从而影响初始细胞的产率；

2、传统成纤维细胞培养方法中采用组织块贴壁法，此技术的缺点是细胞爬出的时间较长，导致整个细胞培养周期较长；

3、传统成纤维细胞培养方法中较多采用动物源性的FBS作为营养物质，因含有动物源性的成分，在临床上是限制使用的；

4、传统成纤维细胞培养方法中使用胶原酶和中性蛋白酶作为组合，但仍不能很好的解决细胞消化后黏连的问题；

5、传统成纤维细胞培养方法中细胞总产量相对较低，较难满足临床使用需求；

6、传统成纤维细胞培养方法中需完全去除表皮组织后再进行培养，操作过程繁琐。

发明内容

本发明的目的在于提供一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法，以解决上述背景技术中提到的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法，其方法包括以下步骤：

步骤1：取样

采集耳后、臀部或大腿内侧全皮层皮肤组织，其具体操作为使用利多卡因进行局部麻醉，使用取样器材取耳后、臀部或大腿内侧约1cm²全皮层皮肤组织，全皮层皮肤组织需要包含表皮层、真皮层及皮下组织，将取得的皮肤组织放置在含皮肤保存液A的离心管内，将离心管放置于温度为2-8℃条件下保存；

步骤2：清洗消毒

采用清洗液将步骤1取得的皮肤组织进行清洗操作；

步骤3：皮肤处理

将步骤2清洗后的皮肤组织刮去皮下组织及脂肪，放置于含皮肤保存液B的离心管内，将离心管放置温度为37℃的二氧化碳培养箱内过夜消化；

步骤4：接种