[发明专利]一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法

权利要求书

1.一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法，其特征在于：其方法包括以下步骤：

步骤1：取样

采集耳后、臀部或大腿内侧全皮层皮肤组织,将取得的皮肤组织放置在含皮肤保存液A的离心管内，将离心管放置于温度为2-8℃条件下保存；

步骤2：清洗消毒

采用清洗液将步骤1取得的皮肤组织进行清洗操作；

步骤3：皮肤处理

将步骤2清洗后的皮肤组织刮去皮下组织及脂肪，放置于含皮肤保存液B的离心管内，将离心管放置温度为37℃的二氧化碳培养箱内过夜消化；

步骤4：接种

将步骤3中经消化后的皮肤组织采用涡旋振荡器震荡8-12秒，将皮肤组织取出，放置于培养皿内，将表皮层与真皮层剥离开，将真皮层加入离心管内，加入生长培养基，吹打组织块使其松散，将表皮层组织与真皮层组织分别接种至6孔板内；

步骤5：补液

将经步骤4接种后的皮肤组织培养3天后，孔内均补加生长培养基，继续培养；

步骤6：换液

取出组织块及培养液，用移液器吹打后，在1000rpm条件下离心5min，离心后的沉淀用新鲜生长培养基重悬后接种至6孔板中，继续培养，每3天更换新鲜生长培养基，直至较多细胞较密集生长区域形成；

步骤7：原代传代消化

吸弃原培养液，采用生理盐水清洗含细胞的培养孔，每孔加入预温的温和消化酶，在二氧化碳培养箱内进行消化，当成纤维细胞大部分变圆脱落，上皮细胞基本未变形时，加入生长培养基终止消化，将消化下来的细胞吸走，将细胞在1000rpm条件下离心5min，离心后用新鲜生长培养基将细胞按照5500-6500个/cm²接种继续培养；

步骤8：传代

当细胞融合度达75％-85％时进行细胞传代，传代后接种继续培养直至需要的代数和数量。

2.根据权利要求1所述的一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤1中所述皮肤保存液A包括DMEM和体积分数为1％的双抗。

3.根据权利要求1所述的一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤2中所述清洗液包括生理盐水、体积分数为1％双抗和160U/ml庆大霉素。

4.根据权利要求3所述的一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤2中对皮肤组织的清洗次数为4-5。

5.根据权利要求1所述的一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤3中过夜消化时间为15-17h。

6.根据权利要求1所述的一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤3中所述皮肤保存液B包括DMEM、胶原酶、DNA酶Ⅰ、HPL和体积分数为1％的双抗。

7.根据权利要求1所述的一种组织块酶联合法培养人皮肤成纤维细胞的方法，其特征在于：所述生长培养基包括DMEM、HPL和体积分数为1％的双抗。