[发明专利]一种等位特异性位点编辑方法

说明书

本发明涉及一种等位特异性位点编辑方法，包括以下步骤：1)取MII期的卵母细胞分为两组，第一组对其进行Cas9 mRNA和靶向目的基因的sgRNA的显微注射，第二组不做任何处理；2)对两组MII卵母细胞同时进行体外受精；3)待胚胎大约发育到受精卵PN3‑4时期，利用原核互换的显微操作方法，将注射组受精卵的雌雄原核分别取出，然后将未处理组受精卵分为两组，一组去掉雌原核，一组去掉雄原核，再将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中；4)将操作后胚胎放入培养箱中等待其充分恢复从而组成一个新的重构胚胎。本发明实现了Cas9活性控制及单等位位点编辑，扩大了基因编辑的应用范围。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基因编辑方法，具体地说，是一种等位特异性位点编辑方法。

背景技术

CRISPR-Cas9基因敲除系统的建立大大简化了基因编辑的操作流程并具有很高的效率，它对生物技术、医学等领域的发展产生了深远的影响。CRISPR-Cas9在sgRNA的引导下能够在体内或者体外条件下特异性的识别基因组序列并且诱导双链断裂(DSBs)。此时，主要激活了非同源末端连接(NHEJ)的修复通路，在断裂位点处随机的引入小片段的插入或者缺失导致编码序列的移码突变。利用NHEJ的相对较高的修复效率这一优势，在受精卵中共注射Cas9 mRNA和靶向目的基因的sgRNA可以有效的产生基因编辑的模式动物。

然而，由于Cas9一旦表达即具有持续切割的活性并且很难精确的在时间和空间的层次上控制Cas9的表达，这将会很大程度地限制Cas9对基因编辑的灵活性，因此仍然会带来许多的弊端。首先，由于持续的Cas9切割活性，通过这种方法产生的胚胎或者出生的动物绝大多数会存在基因型的嵌合结果。其次，对于二倍体生物，在传统的CRISPR-Cas9系统作用下，很难精确的对单等位位点进行编辑。因此，亲缘性等位特异性的基因组位点也不能通过传统的CRISPR-Cas9系统进行选择性的识别或者修改。这些缺陷归根结底是因不能有效的对Cas9活性进行时空特异性控制，这很大程度的限制了Cas9在基因功能性验证或者临床应用的效率。

由于无法高效实现Cas9活性控制及单等位位点编辑，这极大地限制了基因编辑的应用范围。例如产生的基因敲除动物大多是嵌合体，需要进行进一步纯化，耗费大量时间；无法有效得到携带有致死基因突变的动物模型或一步获得杂合敲除动物模型；在机制研究中无法对印记基因进行有效的功能性鉴定；同时在基因治疗中也存在很大的局限性。

专利文献CN109152848A，公开日20190104，公开了一种控制Cas9基因编辑活性的II-C型Cas9抗-CRISPR(Acr)抑制剂，此类Acr抑制剂的共施用可以在下列方面提供有利的辅助：允许通过在空间或时间上控制Cas9活性来进行安全且实用的生物学治疗法；控制在野生群体中的基于Cas9的基因驱动以减轻此类强制遗传计划的生态学后果；和对进入基因编辑技术的各种生物技术、农业和医学应用中的一般性研究作出贡献。然而，该技术也并未很好地解决前述问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供了一种等位特异性位点编辑的方法。

第一方面，本发明提供了一种等位特异性位点编辑方法，包括以下步骤：

1)取MII期的卵母细胞分为两组，第一组对其进行Cas9 mRNA和靶向目的基因的sgRNA的显微注射，第二组不做任何处理；

2)操作后的卵母细胞进行短暂恢复后对两组MII卵母细胞同时进行体外受精；

3)等待胚胎大约发育到受精卵PN3-4时期，利用原核互换的显微操作方法，将注射组受精卵的雌雄原核分别取出，然后将未处理组受精卵分为两组，一组去掉雌原核，一组去掉雄原核；再将注射组分别取出的雌雄原核各自融合到已经弃掉单原核的未处理组受精卵中；

4)将操作后胚胎放入培养箱中等待其充分恢复从而组成一个新的重构胚胎。