[发明专利]一种应用于污染物质和实际水样检测的生物急性毒性检测方法

权利要求书

1.一种应用于污染物质和实际水样检测的生物急性毒性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备若干不同浓度、不同种类的实验样品和阴性对照样品；

（2）按照标准取样方法对实际水体进行取样，并对实际水体样品进行过滤除杂，取得过滤后的水体样品；

（3）在无菌条件下制备发光细菌菌液：取冻干菌，加入复苏液，摇匀后放到4℃下平衡复苏，然后采用2% NaCl溶液稀释至一定发光强度；

（4）生物毒性测试：取稀释后的菌液100µL置于96孔板上，该菌液用微孔板发光检测仪测发光强度，记为I₀，然后加入等体积样品，轻轻震荡，混合均匀，用微孔板发光检测仪测定加入样品15min时发光细菌的发光强度，记为I₁₅；

（5）生物毒性计算：根据发光强度计算发光抑制率，选择适当的函数模型对各实验样品的单一污染物质的“剂量-效应”数据进行拟合，得到污染物质对发光细菌的“剂量-效应”曲线、拟合函数及拟合参数，计算单一的污染物质对发光细菌急性毒性的EC₅₀值；对比阴性对照和实际水样的发光抑制率，测得实际水体的生物毒性；

所述步骤（5）中，96孔板各孔发光抑制率H_t的计算如下：

（1）

式（1）中H_t为加入样品15min后的抑制率，I_t为加入样品后15min后的实际发光强度，I_ct为加入样品15min后的校正发光强度，其计算如下：

（2）

式（2）中I₀为未加入样品和阴性对照时96孔板上活化菌液的发光强度，f_kt为空白平行样校正因子的平均值，0.6f_kt1.8，其计算如下：

（3）

式（3）中I_kt为阴性对照在接触时间为15min后的发光强度；

计算单一污染物质对发光细菌急性毒性的EC₅₀值的函数模型为

（4）

式中，y为抑制率，x为溶液浓度，A₁为标准曲线上渐近线，A₂为标准曲线下渐进线，x₀为标准曲线拐点，p为标准曲线拐点处斜率；

所述步骤（1）中，实验样品种类包括重金属离子和有机溶剂，向其中加入氯化钠，配成一定浓度的溶液，使污染物质NaCl质量浓度为2%，有机溶剂先加入质量浓度为1%的甲醇；

所述步骤（3）中，稀释后发光细菌菌液的发光强度为500-700万RLU；

所述步骤（4）中，用微孔板发光检测仪测发光强度的温度条件为恒温15℃。

2.根据权利要求1所述的应用于污染物质和实际水样检测的生物急性毒性检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中，阴性对照样品为2%NaCl溶液。

3.根据权利要求1所述的应用于污染物质和实际水样检测的生物急性毒性检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中，将配好的实验样品溶液用质量浓度为2%的氯化钠溶液等对数间距梯度稀释，得到2^-1、2^-2、2^-3、2^-4、2^-5、2^-6、2^-7、2^-8、2^-9、2^-10共10个浓度梯度的稀释溶液，共得到11个浓度梯度，每个浓度设置多个平行样；所述步骤（2）中，向水体样品中加入氯化钠，使样品NaCl质量浓度为2%，每个水样设置多个平行样。

4. 根据权利要求1所述的应用于污染物质和实际水样检测的生物急性毒性检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中，微孔板发光检测仪具体型号为Berthold LB960。

5. 根据权利要求1所述的应用于污染物质和实际水样检测的生物急性毒性检测方法，其特征在于：所述步骤（5）中，对实验数据进行处理、分析、绘图的软件为Microsoft OfficeExcel 2016软件和Origin2018软件。