[发明专利]一种高产量水痘病毒培养方法

说明书

本发明公开了一种高产量水痘病毒培养方法，具体包括以下步骤：S1、细胞复苏：将来源于ATCC的工作细胞库MRC‑5细胞复苏传代，细胞生长液为含10～20％新生牛血清的M199‑801培养液，37℃，5％CO₂培养，经过3～4天后，细胞长满单层，准备传下一代；S2、细胞传代：0.01mol/L PBS液洗涤细胞表面两次，加入适量预温EDTA‑Trypsin消化液，待细胞面肉眼观察出现间隙时，弃尽消化液，加入少量细胞培养液，吹打使细胞分散均匀，按1:4～1:8比例进行传代，将细胞最终传代至Corning HYPERStack培养室中，补加入至0.2～0.3ml/cm²的5～10％新生牛血清M199‑801培养液，置37℃、5％CO₂培养。本发明涉及生物医药技术领域。该高产量水痘带状疱疹病毒培养方法，生产规模下，采用本发明方法后，生产产量提升约100％,生产成本约下降40％～50％。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种高产量水痘病毒培养方法。

背景技术

水痘减毒活疫苗是将水痘病毒OKA株在MRC-5二倍体细胞培养繁殖而获得的病毒冻干制品。适用于对12月龄以上的健康儿童、青少年及成人、高危人群及其密切接触者进行水痘预防的主动免疫。带状疱疹减毒活疫苗与水痘减毒活疫苗基本类似，其浓度约是水痘疫苗的10倍。

食品药品监督管理局大力鼓励和引导生产企业通过一次性生产技术提高和保证疫苗的质量。目前水痘病毒疫苗的生产一般通过培养人二倍体细胞(MRC-5、2BS细胞)生产病毒，细胞培养的方法在产均为静置贴壁培养(细胞工厂)。现有技术中细胞工厂培养培养人二倍体细胞来生产水痘病毒的工艺，人二倍体细胞产生的病毒滴度低，单位疫苗生产成本高。针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种利用Corning HYPERStack培养室培养人二倍体细胞制备水痘病毒方法。解决了细胞工厂培养法水痘病毒产量较低的技术问题。

中国发明公开号CN107432931A公开了一种微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法与流程，包括：微载体的预处理、种子细胞的培养、生产细胞的培养、微载体的洗涤、水痘病毒接种、制备疫苗。具体而言，本发明提供一种用生物反应器微载体培养水痘病毒制备疫苗的方法，包括：(1)微载体的预处理：所述预处理包括以重组人血清白蛋白包被微载体；(2)种子细胞的培养：通过细胞培养瓶贴壁培养人二倍体细胞，待细胞长成单层后，胰酶消化制备细胞悬液；(3)生产细胞的培养：在生物反应器中加入步骤(1)预处理的聚苯乙烯微载体、培养液、以及步骤(2)的种子细胞，所述培养液为含10％新生牛血清的完全培养基；(4)微载体的洗涤：当微载体表面细胞单层融合度为80-90％时，收集微载体、以缓冲液洗涤、对洗涤液中的牛血清白蛋白进行检测；(5)水痘病毒接种，接种水痘-带状疱疹病毒侵染 30min，加入无血清培养基继续培养至CPE达到80％以上时收获病毒液。

中国发明公开号CN103074304A公开了高水平人二倍体细胞培养水痘-带状疱疹疫苗病毒方法:采用MEM细胞培养基，加有相当于二倍体细胞培养液体积8～15％的小牛血清，每升二倍体细胞培养液中含有1～5mM的L-谷氨酰胺，每毫升二倍体细胞培养液中含100～200单位青霉素、50-100微克链霉素及20-40纳克两性霉素，二倍体细胞培养液中含有12种非必需氨基酸。12种非必需氨基酸采用 GIBCO BRL生产的100倍浓缩液，且在每升二倍体细胞培养液中的加入量为10ml。

因此开发一种高产量水痘病毒培养方法，提高疫苗产能，间接达到降低疫苗中杂质非常重要。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高产量水痘病毒培养方法，解决了细胞工厂培养法水痘病毒产量较低的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种高产量水痘病毒培养方法，其特征在于：具体包括以下步骤：