[发明专利]一种抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法

说明书

本发明公开了一种抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其预先制备稀释到10^‑2倍,10^‑3倍,10^‑4倍的土壤提取液，并利用大麦粒培养小麦穗腐致病菌，而后利用染有小麦穗腐致病菌的大麦粒与土壤提取液内微生物的抑制效果进行有效筛选，由于染菌大麦粒上的穗腐致病菌非常多，而喷雾稀释的土壤提取液微生物菌数量极少，两者数量上存在绝对悬殊，故能够在穗腐致病菌夹缝中生存的微生物菌落应是繁殖力和抑菌效果很强的菌落，由此有效排除无效微生物菌，其目的性明确，可以大大减少盲目分离土壤微生物菌的工作量，节工节本，且不易漏掉有效微生物菌，从而提升了抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离效率，实用性强。

技术领域

本发明涉及微生物学技术领域，尤其涉及一种抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法。

背景技术

为害小麦、大麦、玉米、水稻等禾本科植物的常见的穗腐致病菌包括玉米赤霉菌、无性阶段禾本科镰孢、麦根腐长蠕孢菌、小麦棒杆菌等。病菌以菌丝体在病残体如稻桩或种子内越冬或越夏，下一生长季形成子囊壳放射出子囊孢子，靠气流传播进行初侵染，分生孢子靠雨水传播再侵染。高温、多雨、多雾和潮湿天气利于本病的发生。

小麦穗腐致病菌的防治方法包括物理防治、化学杀菌剂防治、抗病性小麦品种选育以及生物防治。其中生物防治是利用有益微生物和微生物代谢产物对农作物病害进行有效防治的新方法。例如赤霉病菌虽然能在土壤中繁殖生长，但土壤表面很少观察到赤霉病菌孢子或孢子囊的原因在于土壤中含有大量抑制赤霉病镰刀菌大量繁殖的拮抗菌。故，用于生物防治的微生物包括了从土壤中筛选到的拮抗菌，包括细菌、真菌、少量的放线菌等。

如何从土壤中分离出能有抑制小麦穗腐致病菌生长的拮抗菌是生物防治的重要环节。通常从土壤中分离拮抗菌的方法是先分离出土壤中的所有菌群，然后用牛津杯法做抑制效果实验从而筛选出有拮抗作用的有益菌。但是土壤是微生物生活的大本营，1g土壤中就存在着多达10⁶～10⁹个微生物个体，如果先进行土壤微生物分离再进行抑菌试验，容易造成土壤分离工作量的庞大，而且还易漏掉有抑制作用的有效微生物菌。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑制小麦穗腐病致病菌的土壤微生物菌的分离方法。

实现本发明目的的技术方案是：一种抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其包括以下步骤：

1）土壤提取液的制备：土壤样品采自表层下5～20cm深度土样，从田间采回的土样风干后放入已盛有灭菌水的塑料喷雾器中，充分振荡后的土样溶解液分别稀释到10^-2倍,10^-3倍,10^-4倍，并分别转入喷雾瓶中；

2）大麦粒培养小麦穗腐致病菌：将蒸过或煮过的大麦粒装入培养瓶高温灭菌后冷却到室温，接着向装有大麦粒的瓶中接种小麦穗腐致病菌，并在25～26℃条件下培养若干天，使大麦粒充分长满小麦穗腐致病菌；

3）平板培养基接种携带小麦穗腐致病菌的大麦粒：在数个平板培养基内分别接种若干粒携带小麦穗腐致病菌的大麦粒，并使接种后的携带小麦穗腐致病菌的大麦粒于每个平板培养基上均匀分布；

4）有拮抗作用的微生物菌的初筛：

4.1） 将步骤1）中已经制备好的三种浓度的土壤提取液一一分别均匀喷布到不同的步骤3）所制备的已接种大麦粒的平板培养基表面；喷布后使用封口膜对接种有携带小麦穗腐致病菌的大麦粒的平板培养基边缘进行封口，并在25～26℃条件培养若干天后观察平板培养基中的小麦穗腐致病菌扩张的情况：