[发明专利]一种抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法

权利要求书

1.一种抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：其包括以下步骤：

1）土壤提取液的制备：土壤样品采自表层下5～20cm深度土样，从田间采回的土样风干后放入已盛有灭菌水的塑料喷雾器中，充分振荡后的土样溶解液分别稀释到10^-2倍,10^-3倍,10^-4倍，并分别转入喷雾瓶中；

2）大麦粒培养小麦穗腐致病菌：将蒸过或煮过的大麦粒装入培养瓶高温灭菌后冷却到室温，接着向装有大麦粒的瓶中接种小麦穗腐致病菌，并在25～26℃条件下培养若干天，使大麦粒充分长满小麦穗腐致病菌；

3）平板培养基接种携带小麦穗腐致病菌的大麦粒：在数个平板培养基内分别接种若干粒携带小麦穗腐致病菌的大麦粒，并使接种后的携带小麦穗腐致病菌的大麦粒于每个平板培养基上均匀分布；

4）有拮抗作用的微生物菌的初筛：

4.1） 将步骤1）中已经制备好的三种浓度的土壤提取液一一分别均匀喷布到不同的步骤3）所制备的已接种大麦粒的平板培养基表面；喷布后使用封口膜对接种有携带小麦穗腐致病菌的大麦粒的平板培养基边缘进行封口，并在25～26℃条件培养若干天后观察平板培养基中的小麦穗腐致病菌扩张的情况；

4.2）将步骤4.1）培养的平板培养基中能抑制小麦穗腐致病菌生长的菌落挑取出来，分别涂布于新的平板培养基内，同时勾取部分小麦穗腐致病菌菌丝“之”字型涂布于各初筛的培养基上，而后用封口膜对平板培养基边缘继续进行封口，并在25～26℃条件培养若干天；观察平板培养基内的微生物抑菌情况，从中筛选平板培养基内能够明显抑制小麦穗腐致病菌生长的菌落作为对所选用的小麦穗腐致病菌抑制作用好的菌落。

2.根据权利要求1所述的抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：其还包括步骤5）有拮抗作用的微生物菌的二次筛选：

5.1）挑取步骤4.2）中筛选出的对所选用的小麦穗腐致病菌抑制作用好的菌落，重复4.2）的步骤，纯化挑选出单菌落；

5.2）将经步骤5.1）中纯化后的单菌落分别接种于装有经灭菌处理的大麦粒培养瓶中，并同时将至少两粒步骤2）所培养的接种有小麦穗腐致病菌的大麦粒放入大麦粒培养瓶中，将大麦粒培养瓶封口后在25～26℃培养若干天，培养期内每天摇动玻璃瓶，最后静置1～2d观察菌丝是否得到抑制；

5.3）观察步骤5.2）中的有抑菌作用的微生物菌的抑菌效果，挑选出小麦穗腐致病菌没有明显扩张的对应培养瓶内的微生物菌作为目的拮抗菌。

3.根据权利要求2所述的抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：其还包括步骤6）：对步骤5.3）得到的有拮抗作用的微生物菌的再次筛选：

6.1）将步骤5.3）中挑选出的微生物菌接种于装有经灭菌处理的大麦粒培养瓶中培养得到携带有抑菌效果的微生物菌的大麦粒；

6.2）在若干个新的平板培养皿的中心分别放置一粒携带有小麦穗腐致病菌的大麦粒，而后在每个平板培养皿内于携带有小麦穗腐致病菌的大麦粒外围均匀放置二至四粒步骤6.1）中培养的携带有抑菌效果的微生物菌的大麦粒，观察抑菌效果，从中选出小麦穗腐致病菌没有明显扩张、拮抗作用较好的对应培养皿内的微生物菌作为目的拮抗菌。

4.根据权利要求3所述的抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：步骤6.2）中平板培养皿上放置四粒步骤6.1）培养的有抑菌效果的微生物菌的大麦粒时，放置方法为：制作若干个白底黑字的塑料圆形十字刻度板，每个十字刻度板的直径与平板培养皿的外径相等，接菌前，先将一个十字刻度板对齐放置于一个新的平板培养皿的正下方，平板培养皿为透明结构，平板培养基呈半透明状，将一粒携带有小麦穗腐致病菌的大麦粒放于十字刻度板的正中心，并将四粒步骤6.1）中携带有抑菌效果的抑菌效果的微生物菌的大麦粒分别放置在由十字刻度板映射在平板培养基上的十字影像上。

5.根据权利要求1所述的抑制小麦穗腐致病菌的土壤微生物菌的分离方法，其特征在于：所述小麦穗腐致病菌为赤霉病镰刀菌、灰霉病菌、黑穗病菌、青霉和黄曲霉中任意一种可以在大麦粒上繁殖的有害菌。