[发明专利]一种微藻制备D-阿洛酮糖的方法

说明书

本发明提供了一种微藻制备D‑阿洛酮糖的方法。该方法利用纤维素酶对微藻干物质进行酶解糖化得到微藻酶解液，同时构建一株具有生物转化D‑阿洛酮糖的大肠杆菌重组菌株，利用该重组菌株对微藻酶解液进行异构化转化，将产物进行色谱分离处理，最后得到95％纯度的D‑阿洛酮糖。本发明以微藻为原料制备D‑阿洛酮糖，可以有效地降低D‑阿洛酮糖的生产成本，对于加速其工业化进程具有积极意义。

技术领域

本发明涉及基因工程、生物催化技术和生物发酵领域，具体涉及一种生物转化D-阿洛酮糖的大肠杆菌重组菌以及利用该重组菌以微藻为原料制备D-阿洛酮糖的方法。

背景技术

稀有糖是指在自然界存在但含量极少的一类单糖及其衍生物，其在膳食、保健、医药等领域中具有重要的潜在应用价值。D-阿洛酮糖，果糖C-3异构体，作为稀有糖之一，其甜度是蔗糖的70％，而热量仅为后者的0.3％，是蔗糖的良好替代品。动物实验证明D-阿洛酮糖具有独特的营养学和生理学功能，如能降低血糖，可作为II型糖尿病人的辅助治疗剂、膳食补充剂和甜味剂；能降低血脂，减少脂肪合成酶活性，抑制腹腔内脂肪堆积等。D-阿洛酮糖具有独特的营养学和生理学功能，2011年被美国食品及药品管理局(FDA)批准为GRAS(一般认为安全，Generally Recognized as Safe)食品，允许应用于医药制剂、食品、膳食补充剂中，其开发前景广阔，具有优良的应用价值。

自然界中，D-阿洛酮糖的含量极少，其生产方法可分为两种：化学法和生物法。化学法的副产品多，分离纯化困难。生物法具有反应简单，产物单一，纯化方便等优点。生物转化法主要利用Carbohydrate Epimerase(糖类差向异构酶)、Oxidoreductases(氧化还原酶)、Keto-aldol Isomerases(醛酮糖异构酶)等酶作为催化剂，在不同单糖(主要为四碳糖、五碳糖、六碳糖)之间相互转化以获得目的稀有糖。在上述酶中，D-塔格糖-3-差向异构酶(DTEase)可催化D-果糖的C-3位差向异构，生成D-阿洛酮糖。第一个被发现的DTEase因其最适底物为D-塔格糖而命名，随后在不同的微生物中，如Agrobacterium tumefaciens、Rhodobacter sphaeroides SK011、Clostridium cellulolyticum H10、Ruminococcussp.、Clostridium scindens、Desmospora sp.、Dorea sp.CAG317、Treponema primitia和Arthrobacter globiformis等菌株均发现该酶的存在，且因为该酶的最适底为D-阿洛酮糖，因此又称为D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)。

国内外有许多文献报道关于以果糖为底物，D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化制备D-阿洛酮糖的研究。但是D-果糖的价格昂贵，导致D-阿洛酮糖的生产成本相当昂贵。以相对低廉的D-葡萄糖为原料制备D-阿洛酮糖受到了研究人员的关注。

木质纤维素生物质是自然界最丰富且廉价的原料，由纤维素水解产生的葡萄糖含量可达20-50％，利用纤维素原料发展综合生物炼制为高值产品经济化带来新的方向。以纤维素为原料制备D-阿洛酮糖鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低成本的，高效的，适合工业化制备D-阿洛酮糖产品的方法，具体提供一种微藻制备D-阿洛酮糖的方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种微藻制备D-阿洛酮糖的方法，包括以下步骤：

(1)将微藻进行酶解处理，得到含有糖化产物的混合物；

(2)将步骤(1)得到的混合物与大肠杆菌重组菌株混合进行异构化反应，得到葡萄糖/果糖/D-阿洛酮糖的混合物，将混合物分离，得到D-阿洛酮糖；

所述的大肠杆菌重组菌株含有D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因DPE和木糖异构酶基因XYLA。