[发明专利]一种低蛋白含量的无血清无饲养层胚胎与多能干细胞培养基

说明书

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种低蛋白含量的无血清无饲养层胚胎与多能干细胞培养基。该无血清培养基由NaHCO₃、亚硒酸钠、乙二胺四乙酸铁、L‑抗坏血酸、硫酸锌、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β、小分子抑制剂SB‑216763、小分子抑制剂5‑AzaC、叶酸和基础培养基组成。本发明提供的无血清培养基成分明确、无动物源、蛋白含量极低，能够实现ESCs快速增殖的同时维持细胞的未分化状态。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种低蛋白含量的无血清无饲养层胚胎与多能干细胞培养基。

背景技术

胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)主要从着床前的囊胚内细胞团(innercell mass，ICM)中分离获得，是一种多能干细胞，可以分化成体内几乎所有的细胞类型细胞、形成人体的组织和器官。1981年Kaufman和Evans首次建立了小鼠胚胎干细胞系，这一重大的科学进展使围绕胚胎干细胞的研究成为了科学家们的研究热点并取得更大的突破。1998年Tomson等首次成功分离得到了人类胚胎干细胞；2008年，科学家成功分离得到了大鼠胚胎干细胞。2016年中国科学院周琪院士的团队成功将小鼠胚胎干细胞体外分化成具有功能的精子细胞并产生可育后代。2018年澳大利亚的研究人员成功用干细胞修复帕金森患者脑中受损的多巴胺神经元。2019年1月9日世界首例人胚胎干细胞分化功能细胞治疗半月板损伤在华中科技大学同济医学院附属同济医院康复医学科顺利完成。

胚胎干细胞具有无限增殖、自我更新和多向分化的潜能，在体外特定的培养条件下能够不断的进行自我增殖并保持细胞的未分化状态，同时还可以分化为三胚层(内胚层、中胚层和外胚层)中的任何一种细胞类型。因此，ESCs在理论研究、临床应用等方面都具有广阔的应用前景，(1)可作为研究动物细胞生长分化和组织器官发育构建的有力工具；(2)用于建立体外疾病模型以便研究疾病的形成机制；(3)药物筛选和开发，体外将ESCs诱导分化为特定的细胞类型后加药物处理，研究药物对特定组织或细胞的毒性作用；(4)细胞治疗，如产生特定的细胞来替代各种疾病患者受损的组织或器官，从而用于治疗糖尿病、肝病、帕金森疾病和脊髓损伤等疾病；(5)基因治疗。

ESCs巨大的应用前景，决定了建立一种能够保证ESCs数量和质量的培养体系成为一种迫切的需求。胚胎干细胞的培养主要经历有血清有饲养层培养、无血清有饲养层培养和无血清无饲养层培养三个阶段。这些培养方法或多或少存在一些缺陷。有饲养层的培养体系中，ESCs的质量往往受到饲养层细胞状态的影响；饲养层细胞指能够分泌细胞外基质、黏附因子和各种生长因子，起到促进ESCs贴壁、增殖并抑制其分化作用的细胞。鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、包皮成纤维细胞、间充质干细胞等均可作为ESCs培养的饲养层，其中MEF由于取材方便、抑分化效果好、易于分离等特点成为最为常用的饲养层。虽然饲养层细胞能够为ESCs提供较为理想的微环境，但是其携带的动物源蛋白和病原体易引起机体免疫反应。此外，饲养层细胞存在批次间的差异，制备过程繁琐，需要耗费大量的人力、物力和时间投入。血清同样存在成分不明确，含有大量的外源性物质和微生物感染(如病毒、支原体和内毒素等)等问题。这些因素影响研究实验的重复性，同时大大限制了ESCs在临床上的应用。

为了克服饲养层和血清带来的问题，很多研究者一直尝试建立一种无血清、无饲养层的ESCs培养体系。无血清、无饲养层培养体系指使用细胞外基质替代饲养层的基础上，采用无血清培养基对ESCs进行培养的体系。细胞外基质主要由细胞合成并分泌的大分子组成，如糖胺聚糖、蛋白多糖、胶原蛋白和黏连蛋白等，这些大分子影响着ESCs的贴壁、增殖和形态等。ESCs体外培养常用的胞外基质有基质胶、明胶、胶原、层黏连蛋白、纤连蛋白等。无血清培养基(SerμM-Free MediμM，SFM)指在基础培养基的基础上添加能够代替血清功能的各种因子形成的培养基，这些添加因子主要包括激素(如胰岛素、生长激素和胰高血糖素等)、生长因子、白蛋白、转铁蛋白、微量元素和维生素等。