[发明专利]第101位点发生突变的橡胶树EPSPS基因及其检测方法和应用

说明书

本发明公开了第101位点发生突变的橡胶树EPSPS基因及其检测方法和应用，第101位点发生突变的橡胶树EPSPS基因经转基因验证是草甘膦的抗性基因，主要表现在莽草酸含量提高和种子重量提高；所发生的突变是101位氨基酸由G突变成A，本发明提供的EPSPS突变基因为揭示植物草甘膦药害机制和转基因检测提供依据；本发明提供的EPSPS基因点突变的检测方法，可以快速准确经济地分析HbEPSPS基因突变信息，可用于草甘膦靶标HbEPSPS检测和分析。

技术领域

本发明涉及农药学和分子生物学领域，具体涉及第101位点发生突变的橡胶树EPSPS基因及其检测方法和应用。

背景技术

Monsanto公司在1971年开发出广谱灭生性的除草剂草甘膦(Glyphosate)，商品名为农达。草甘膦为灭生性除草剂，是目前应用较广销售量较大的一类有机磷农药，具有高效性与广谱性。因其能有效治理田间单子叶和双子叶、一年生和多年生杂草而被广泛大量使用。田间施药过程中，由于施药不准确和药剂漂移等原因常会造成经济作物药害。

草甘膦主要通过抑制植物体内莽草酸途径中5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)，阻碍植物合成苯丙氨酸、苏氨酸及酪氨酸，抑制合成植保素等植物次生代谢物，影响植物正常生理生化反应，严重可导致植物死亡。草甘膦作用的关键位点是EPSPS蛋白，研究证明了B.diandrus对草甘膦比野生型植物高出近五倍的遗传抗性是由于EPSPS基因扩增引起的。将EPSPS基因的T-DNA转化导入水稻中产生抗草甘膦水稻。转草甘膦耐受基因G2-EPSPS大豆显示出对草甘膦的高耐受性。通过转入表达密码子修饰的CP4-EPSPS使转基因水稻获得5倍致死剂量的草甘膦抗性。采用定点突变EPSPS中T42M，发现能够增加草甘膦抗性。说明通过筛选EPEPS点突变基因来筛选草甘膦抗性植株是直接有效的。此外，在拟南芥中采用定点突变EPSPS基因的方法使得转基因植株获得抗草甘膦性状。许多高等植物、细菌均含有3个保守结构域，改变其中一点可改变酶的活性和草甘膦的抑制作用。在橡胶树中，发现草甘膦能破坏橡胶树叶片叶绿体结构、导致抗氧化酶活性增加及可溶性糖含量下降。喷施植物逆境脱落酸(ABA)能够显著缓解橡胶树幼苗由草甘膦造成的药害。经检索发现现有技术尚未有橡胶树草甘膦抗性相关的EPSPS点突变技术报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一个橡胶树5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(HbEPSPS)的突变基因，即第101位点发生突变的橡胶树EPSPS基因，证明转点突变基因拟南芥具有对草甘膦抗性提高功的能；

本发明的第二目的在于提供一种EPSPS基因的点突变扩增引物；

本发明的第三目的在于提供一种EPSPS基因点突变的检测方法；

本发明的第四目的在于提供一种EPSPS点突变转基因植株的构建方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种EPSPS突变基因，EPSPS基因在101位点的氨基酸由G突变成A，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

EPSPS突变基因在制备用于检测植物样品中草甘膦抗性试剂盒中的应用。

进一步地，所述植物为橡胶树或拟南芥。

一种EPSPS基因的点突变扩增引物，所述点突变扩增引物为HbEPSPS-G101A-F和HbEPSPS-G101A-R，HbEPSPS-G101A-F的序列如SEQ ID NO：6所示，HbEPSPS-G101A-R的序列如SEQ ID NO：7所示，具体为：

HbEPSPS-G101A-F：5’-TACCGTCTACTTGCCGGCTTCCAAGTCTCT-3’，

HbEPSPS-G101A-R：5’-GCCGGCAAGTAGACGGTACCGGAGATTT-3’。

一种EPSP基因点突变的检测方法，它包括以下步骤：