[发明专利]第101位点发生突变的橡胶树EPSPS基因及其检测方法和应用

权利要求书

1.一种EPSPS突变基因，其特征在于EPSPS基因编码蛋白在101位点的氨基酸由G突变成A，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述EPSPS突变基因在制备用于检测植物样品中草甘膦抗性试剂盒中的应用，所述植物为橡胶树或拟南芥。

3.一种EPSPS基因的点突变扩增引物，其特征在于，所述点突变扩增引物为HbEPSPS-G101A-F和HbEPSPS-G101A-R，HbEPSPS-G101A-F的序列如SEQ ID NO：6所示，HbEPSPS-G101A-R的序列如SEQ ID NO：7所示。

4.一种如权利要求1所述的EPSP突变基因的检测方法，其特征在于，它包括以下步骤：

S1.提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链；

S2.以cDNA第一链为模板，HbEPSPS-F和HbEPSPS-R为引物，通过PCR扩增反应获得橡胶树HbEPSPS基因的cDNA序列；

其中，所述引物HbEPSPS-F的序列如SEQ ID NO：2所示，所述引物HbEPSPS-R的序列如SEQ ID NO：3所示；

S3.将通过PCR扩增反应获得的HbEPSPS基因的cDNA片段连接至pMD18-T载体中，并转化大肠杆菌DH5α菌株中进行克隆和测序验证；

S4.以cDNA第一链为模板，HbEPSPS-HindIII-F和HbEPSPS-BamHI-R为引物采用PCR技术扩增和产物胶回收；

其中，所述引物HbEPSPS-HindIII-F的序列如SEQ ID NO：4所示，所述引物HbEPSPS-BamHI-R的序列如SEQ ID NO：5所示；

S5.将步骤S4回收的产物连接到pMD18T载体，转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态；

S6.重组子筛选，菌落PCR和测序鉴定。

5.一种如权利要求1所述的EPSPS突变基因的转基因植株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链；

S2.以cDNA第一链为模板，HbEPSPS-F和HbEPSPS-R为引物，通过PCR扩增反应获得橡胶树HbEPSPS基因的cDNA序列；

其中，所述引物HbEPSPS-F的序列如SEQ ID NO：2所示，所述引物HbEPSPS-R的序列如SEQ ID NO：3所示；

S3.将通过PCR扩增反应获得的HbEPSPS基因的cDNA片段连接至pMD18-T载体中并转化大肠杆菌DH5α菌株中进行克隆和测序验证，测序验证正确的质粒命名为HbEPSPS-18T；

S4.以HbEPSPS-18T为模版，采用点突变引物HbEPSPS-G101A-F和HbEPSPS-G101A-R为引物PCR扩增反应获得HbEPSPS基因的cDNA序列，并将其cDNA片段连接至pMD18-T载体中并转化大肠杆菌DH5α菌株中进行克隆和测序验证，测序验证正确的质粒命名为HbEPSPS-G101A-18T；

其中，所述点突变引物HbEPSPS-G101A-F的序列如SEQ ID NO：6所示，所述点突变引物HbEPSPS-G101A-R的序列如SEQ ID NO：7所示；

S5.以HbEPSPS-G101A-18T为模版，带有酶切位点的引物HbEPSPS-HindIII-F和HbEPSPS-BamHI-R扩增cDNA序列，其中，所述引物HbEPSPS-HindIII-F的序列如SEQ IDNO：4所示，所述引物HbEPSPS-BamHI-R的序列如SEQ ID NO：5所示，利用电击法将带有HbEPSPS基因cDNA序列的质粒转化农杆菌并转化目标植物拟南芥野生型Col-0，获得转基因稳定遗传拟南芥植株。

6.根据权利要求5所述的一种构建方法，其特征在于，步骤S2中扩增PCR仪反应程序如下：94℃预变性3min然后，94℃条件下变性30s，50℃条件下退火50s；72℃条件下延伸2min30s；循环35次，最后72℃延伸10min，4℃保存。