[发明专利]一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用，属于生物技术领域。消化道腺病毒主要包括人类腺病毒40型和41型，该试剂盒针对人类腺病毒40型和41型设计特异性引物和探针以及PCR反应体系，其中特异性引物和探针由人类腺病毒40型及41型全基因组的共同序列、内参片段的特异性引物和探针组成。该试剂盒能精准检测到40型及41型的人类腺病毒，且不会受到其它非40型、41型人类腺病毒及其它微生物的序列影响，实现高敏感性和高特异性，解决了目前引物设计中敏感性和特异性不能均优的难点问题，同时本发明采用“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，根据拷贝数、引物二聚体和序列空间结构等关键技术参数，寻找最佳靶序列，使检测效率、精准度大大提高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒及其应用。

背景技术

腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈二十面体排列构成。衣壳内部为线状双链DNA分子，自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人类腺病毒有52种，分为A、B、C、D、E和F六个亚群(subgroup)。消化道腺病毒属于F亚群，且以40和41两个型别为主。

人类腺病毒可诱发多种感染，包括呼吸道感染、眼部感染、消化道感染等。许多人类腺病毒在肠道细胞中复制，随粪便排出。大多血清型与胃肠道疾病无关，但人类腺病毒40型和41型可致病，是引起婴幼儿与年少儿童(4岁以下)的胃肠炎，致腹痛、腹泻的主要原因。

消化道腺病毒的常用鉴定方法如下：(1)培养：病毒株培养特异性较高，是获得病毒株并进行流行病学调查所必需的，技术要求高，操作复杂，临床实验室普遍没有开展；(2)酶联免疫试验检测细胞毒素抗体：间接反映感染状况，检测病毒抗体快速，方法重复性差、敏感性低、特异性不强；(3)胶体金法检测细胞毒素的抗原：敏感性低和重复性差，特异性较好。由于上述的实验室检查方法分别有敏感性差，特异性低，检测周期长，设备要求高，重复性差等缺点，使检查结果经常出现假阳性或假阴性，导致误诊、漏诊。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒，该试剂盒可特异、敏感、准确、快速地检测粪便样本中的消化道腺病毒。

为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：利用自主研发的“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，在国际权威数据库GenBank核酸数据库(Nucleotide)中下载人类腺病毒40型及41型的参照序列(40型GenBank：KU162869.1，序列长度34,210bp；41型GenBank：KY316161.1，序列全长34,198bp)。以此参照序列为模板，建立候选短片段文库、片段特异性和敏感性评估、引物设计、引物性能评估、临床样本验证等，在此基础上开发出一种敏感性高、特异性强、成本低、检测通量更大的消化道腺病毒的PCR荧光检测试剂盒。基因是识别生物物种的名片，寻找特异而保守的基因序列如同大海捞针，是决定试剂盒特异性、敏感性的关键。本发明的创新之处在于：1)此试剂盒能精准检测到不同血清型的消化道腺病毒，且不会受到其他非消化道腺病毒(特别是呼吸道腺病毒)以及其它微生物的序列影响，实现高敏感性和高特异性，解决了目前引物设计中敏感性和特异性不能均优的难点问题；2)本发明所采用的“鸬鹚”生物大数据挖掘系统，可以对数千万碱基对的全基因组序列进行全面筛查，找到几十个至几百个特异保守序列，再根据拷贝数、引物二聚体和序列空间结构等关键技术参数二次筛查，优中选优，找到最佳靶序列，使检测效率、特异性、敏感性相比于常规设计方法提高10倍。本发明专利中的引物设计方法采用自主研发的鸬鹚大数据挖掘系统，在消化道腺病毒全基因组(长度约34000bp)范围内搜寻最优的引物和探针片段，相比传统方法只针对Hexon基因(约3000bp)设计引物，扩大了搜索范围10倍以上，而且所用时间较短，效率更高。