[发明专利]一种携带AIM2基因的溶瘤腺病毒的构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种携带AIM2基因的溶瘤腺病毒的构建方法，属于生物医学技术领域。首先通过PCR反应和克隆技术，构建CAIX启动子载体pZD55‑CAIX，接着构建腺病毒穿梭质粒pZD55‑CAIX‑AIM2，最后将通过鉴定的质粒pZD55‑CAIX‑AIM2与腺病毒骨架质粒pBHGE3共转染HEK293细胞，待细胞出现病毒噬斑后，得到目的溶瘤腺病毒Ad‑CAIX‑AIM2。该溶瘤腺病毒能特异地到达肿瘤细胞部位，高效、特异性杀伤肿瘤细胞，而不影响正常细胞，并且在肿瘤组织中的复制能力强。

技术领域

本发明涉及一种溶瘤腺病毒的构建方法，特别是一种携带AIM2治疗基因的肿瘤特异性溶瘤腺病毒的构建方法及应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

肾细胞癌(Renal cell carcinoma，RCC)简称肾癌，占成人恶性肿瘤的2％-3％，是致死率最高的泌尿系统肿瘤，其发病率正以每年约2.5％的速度上升。肾癌恶性度极高且不易早期发现，确诊时30％已有转移，根治术后仍有20％～30％患者发生转移，转移性患者2年死亡率高达95％。放化疗及细胞因子治疗均不理想，目前临床治疗转移性患者多采用索拉非尼(Sorafenib)为代表的酪氨酸激酶抑制剂，但其耐药性高，控制疾病进展仅达6个月。因此，针对晚期肾癌亟需新的治疗手段。

溶瘤腺病毒(Oncolytic adenovirus，OAd)是指经基因工程改造，能够在肿瘤细胞内复制并将其杀伤，释放出子代病毒继续发挥作用的一类腺病毒。1996年Onyx公司在Science上报道，敲除E1B 55KD蛋白编码基因的腺病毒Onyx-015，仅在肿瘤细胞内复制并将其杀伤，而不影响正常细胞，从而开启溶瘤病毒(Oncolytic virus，OV)治疗肿瘤的大门。OV一直是肿瘤治疗研究的热点。目前，腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、柯萨奇病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒等多种OV已进入临床试验。2000年至今已完成Onyx-015治疗肿瘤Ⅰ～Ⅲ期临床试验18项。2006年国内开发的同类病毒H101上市，成为世界上首个OAd药物。2015年FDA批准Amgen公司基因改造型HSV-1产品T-Vec治疗晚期黑色素瘤，成为OV治疗肿瘤的里程碑，目前，T-Vec已在美国、欧洲和澳大利亚广泛应用。2017年5月，江苏恒瑞医药斥资1.02亿美元购买日本Oncolys BioPharma公司的hTERT启动子调控的OAd药物OBP-301。OAV再次引起人们的极大关注。尽管临床试验证明Onyx-015治疗安全性高，但杀伤肿瘤作用较弱，单用疗效仅15％。为提高Onyx-015抗肿瘤作用，本发明人曾使用Onyx-015改造的载体pZD55，携带抗癌基因，一定程度上提高了Onyx-015治疗肾癌效果。然而，Onyx-015改造时缺失了E1B 55KD蛋白编码基因，使其复制能力下降，影响治疗效果。

碳酸酐酶9(Carbonic anhydrase IX，CAIX)也称为G250，是碳酸酐酶家族异构体之一，是由酸性氨基酸组成的跨膜糖蛋白，在调控细胞增殖、转化方面有重要作用。CAIX在肾癌、肝癌、胃癌、膀胱癌等中高度表达，而在正常组织，如胃、胆管、胰腺、小肠和输精管上皮极少表达且表达量极少。因此，CAIX作为这些实体肿瘤的相关特异性抗原。已有研究证明CAIX启动子的OAd可以特异性靶向杀伤肾癌细胞。

黑色素瘤缺乏因子2(Absent in melanoma,AIM2)是干扰素诱导蛋白家族成员，能作为胞质DNA感受器识别双链DNA，从而招募胞质接头蛋白ASC，并诱导炎性复合体的组装，继而引起Caspase-1的激活和IL-1β，IL-18的产生。AIM2还作为一个肿瘤抑制基因参与肿瘤的发生发展。在子宫内膜癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、胃癌和结肠癌等一些恶性肿瘤中发现AIM2基因的失活，缺失或者突变现象。在黑色素瘤的发生过程中，过表达AIM2可逆转黑色素瘤的肿瘤表型，延迟小鼠纤维原细胞的增殖。结直肠癌患者肿瘤细胞中AIM2表达缺失与其预后不良密切相关，AIM2在肾癌实体肿瘤中低表达，过表达AIM2抑制肿瘤细胞的生长、转移和侵袭。这些研究提示，AIM2基因表达改变在肿瘤的进展过程中扮演着重要的作用。

发明内容